运动结合甲鱼油对老年肥胖大鼠chemerin的影响*

宋威巍， 柏友萍△， 苏 敏， 王 明， 沈瑞睿， 杜康健， 夏行权， 聂刘旺

(1. 安徽师范大学体育学院， 芜湖 241003； 2. 安徽省生物资源保护和利用重点实验室， 安徽师范大学， 芜湖 241000)

随着经济的发展和人民生活的提高，我国超重及肥胖人群的比例在逐年增加，老年人超重与肥胖人群也在逐年不断增加。2010年，我国成年人超重比例为32.1%，肥胖率为9.9%[1]。肥胖不利于健康，易增加老年人各种疾病发病率，如胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压及相关炎症。新近研究发现，脂肪细胞因子chemerin参与调节脂肪细胞分化、肥胖和胰岛素抵抗等生理过程[2-3]。

运动既可减肥，又能促进身体健康。因此，运动对chemerin、血糖水平及胰岛素敏感性的影响受到广泛关注[4]。目前，尚不清楚甲鱼油、运动结合甲鱼油对chemerin mRNA和蛋白表达、血糖水平、胰岛素敏感性的影响。本实验建立老年肥胖SD大鼠实验动物模型，采用qRT-PCR、Western blot和ELISA技术，探讨甲鱼油、运动结合甲鱼油对老年肥胖大鼠chemerin和胰岛素敏感性及血糖水平的影响，为防治老年肥胖引起的2型糖尿病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立与分组

雄性SD大鼠50只，鼠龄3周，测定体重(74.46±7.43)g和体长(12.37±0.52)cm，先适应性喂养1 d。根据体重无差异性(P>0.05)原则，将SD雄性大鼠随机分为对照组(n=12)和实验组(n=32)，所有大鼠均自由饮食、饮水。对照组大鼠喂食脂肪含量比为6.0%的普通饲料。实验组大鼠喂食高脂饲料，生长发育期大鼠喂食的高脂饲料的脂肪含量比为36.3%，壮年期和老年期大鼠喂食的高脂饲料的脂肪含量比为40.0%。建模期间，室温18℃～22℃，相对湿度50%～70%，每天光照12 h，每天定时观察饮水量、饮食量和排泄量，每周测量一次体长和体重并详细记录。

老年肥胖SD大鼠建模成功的依据为：鼠龄为60周，肥胖组大鼠体重大于对照组体重的120%[5]。对照组大鼠平均体重为(758.73±45.57)g，建模成功标准的老年肥胖大鼠体重为910.48 g，实验组大鼠平均体重为(929.56±81.54)g。在建模成功的老年大鼠中，选取24只并随机分为4组：肥胖对照组(obese control group，OC)、甲鱼油组(turtle oil group，TO)、运动组(exercise group，OE)、运动结合甲鱼油组(obese supplement of turtle oil combined with exercise group，OET)，从自然生长大鼠中随机选取6只为对照组(control group，C)。

1.2 仪器与试剂

仪器：酶标仪(Tecan Sunrise/瑞士)，洗板机(Tecan Columbus Washer/瑞士)；电子秤(JM-A20001/中国)称体重；全自动生化分析仪(日立7060)；6跑道大鼠跑台(Wi32812/北京)；PCR仪(MJ research，PTC200)，台式高速离心机(eppendorf，Centrifuge5417)，高速冷冻离心机(力康生科，Neofuge15R)，实时荧光定量PCR仪(博日，line-gene K FQD-48A)；凝胶成像系统(江苏捷达科技，JD801)，可见紫外分光光度计(日立，U-2001)。

试剂：测定chemerin mRNA的主要试剂：Trizol(SunShineBio/SN114)，M-MLV反转录酶(Promega/M1705)。测定chemerin 蛋白表达的主要试剂：6×SDS protein loading buffer(还原型)(Sunshinebio/SN336)，电泳液缓冲液(25 mmol/L Tris，0.25 mol/L甘氨酸，0.1%SDS，Sunshinebio/SN343)，兔抗chemerin抗体(Bioss/bs-1501R)，羊抗兔IgG-HRP(H+L)(Sunshinebio/SN134)，小鼠抗β-actin抗体(Boster/BM0627)，羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(Sunshinebio/SN135)，PageRuler Prestained Protein ladder(Fermentas/SM0671)。chemerin血浆浓度试剂盒(美国TSZ公司)；血糖试剂盒(北京利德曼生化股份有限公司)。

1.3 运动及甲鱼油方案的设计与实施

本运动方案的设计以本实验室前期研究为依据进行相关改进[6]。运动干预前，对运动组大鼠进行为期5 d的适应性跑台训练，最后根据老年肥胖大鼠的运动能力设定的运动强度为：大鼠跑台坡度0°，速度15 m/min，每组运动15 min，4组/次，组间休息5 min，总运动时间60 min，1次/日，每周5次(周二和周五休息)，持续8周。对照组不施加运动和甲鱼油干预，安静状态下笼养。

本实验使用的甲鱼油是委托安徽省生物资源保护和利用重点实验室聂刘旺教授提供，系采用新鲜的甲鱼为材料，以国内实验室公认的索氏提取法，利用脂溶性溶剂提取的甲鱼油，其纯度为99.9%，主要成分为油酸、α-亚麻酸及花生四烯酸等。补充甲鱼油为运动后1 h灌胃，剂量以本实验室前期共轭亚油酸SD大鼠灌胃的研究为依据[7]，本次老年肥胖大鼠补充甲鱼油0.3～0.4 ml/次(人体推荐量4.8 g/60 kg体重的4倍)[8]，OET组为大鼠运动后休息1 h后灌胃，对照组大鼠采用等体积生理盐水灌胃，5次/周，持续8周。

1.4 样本采集与保存

大鼠8周干预后禁食12 h、禁水6 h。大鼠腹腔内注射10%水合氯醛溶液(1.22 mg/kg体重)麻醉，剖腹取大鼠腹主动脉血，立即分离血浆，测定血浆chemerin浓度、血糖及胰岛素水平。血糖水平采用全自动生化仪测定。内脏脂肪组织为大鼠肾周和附睾的脂肪组织，用滤纸吸干表面组织液，取部分脂肪组织立即置于Trizol中，按照说明书提取总RNA；另取部分脂肪组织包在锡箔纸中，置-80℃冰箱保存，分别测chemerin mRNA和蛋白质表达。

1.5 qRT-PCR检测内脏脂肪组织chemerin mRNA表达

chemerin的引物：Forward：5'-ATCAAACCAAATGGGAGGAAGC-3'； Reverse：5'-GGGAAGAAGTAGATGCGGGAGTC-3'； β-actin的引物: Forward：5'-CTAGAGGGTGTCCGCAATG-3'； Reverse：5'-CAGTGGGAAGGTGTAGTCAGTC-3'。

以Trizol法提取内脏脂肪组织细胞总RNA，通过反转录反应使全长mRNA反转录成cDNA，短暂离心，通过预变性、变性、退火及延伸进行PCR扩增。融解曲线分析：60 ℃～95 ℃环境下，温度每次升高0.3℃，时间间隔为5 s，chemerin的Tm值为83℃。根据上述实验得出的数据，软件自动计算出阈值与Ct值，△Ct= Ct(目的基因)- Ct(β-actin)，相对定量采用2-△Ct法。chemerin mRNA基因表达量结果采用2-△Ct×1000。

1.6 Western blot法检测内脏脂肪组织chemerin蛋白表达

用SDS-PAGE分离蛋白质后，用湿转法将蛋白质转移到PVDF膜上。将膜放置于封闭液中，滴加一抗(兔抗chemerin抗体)后37℃孵育3 h，室温下于脱色摇床上用TBST洗4次，10 min/次；然后加入TBS液中，滴加二抗37℃孵育1 h，室温下于脱色摇床上用TBST洗5次，10 min/次。进行化学发光反应，在显影液中冲洗胶片，之后放入定影液中漂洗10 s；用水冲洗后室温静置晾干。扫描胶片，测定目的条带的净吸光度值。

1.7 ELISA检测血浆chemerin浓度和胰岛素浓度

采用ELISA(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)的双抗体夹心法，测定大鼠血浆标本中chemerin和胰岛素浓度。在Excel工作表中，横坐标为标准品浓度，纵坐标为相对应的A值，得出标准品线性回归曲线。chemerin浓度值：曲线方程为y=0.039x-0.026，标准品试剂测量值与实际测量值相关系数r=0.999。胰岛素浓度值：曲线方程为y=0.020x+0.008，标准品试剂测量值与实际测量值相关系数r=0.999。把该方程代入Excel工作表中，得到相应的浓度值，再乘以5为样本实际浓度。以胰岛素敏感性指数(insulin sensitivity index，ISI)反映胰岛素敏感性，ISI计算公式：ISI=1/[log(I0)+log(G0)]，I0代表空腹胰岛素含量(μU/ml)，G0代表空腹血糖浓度(mmol/L)[9]。

1.8 统计方法

2 结果

2.1 老年肥胖大鼠内脏脂肪组织chemerin mRNA和蛋白质表达的变化

chemerin mRNA表达：OC组呈现高于C组的趋势(P>0.05)，OE、TO组与OC组无统计学差异，OET组呈低于OC、OE、TO组的趋势(P>0.05，表1)。chemerin 蛋白质表达：OC组与C组无明显差异(P>0.05)；OE、TO组均低于OC组(P<0.05)；OET组明显低于OC、OE、TO组(P<0.01，表1，图1)。

GroupnChemerin mRNAChemerin proteinC51.612±0.2570.911±0.020OC51.767±0.1121.057±0.075**OE61.744±0.2550.857±0.080**#TO51.763±0.2870.870±0.074**#OET61.518±0.2720.586±0.013

C： Control group； OC： Obese control group； OE： Obese exercise group； TO： Turtle oil group； OET： Obese supplement of turtle oil combined with exercise group

**P<0.01vsOET group；#P<0.05vsOC group

2.2 老年肥胖大鼠血浆chemerin 浓度、血糖水平及ISI的变化

血浆chemerin浓度：OC组明显高于C组(P<0.01)；TO、OE、OET组均明显低于OC组(P<0.05，P<0.01)。血糖水平：OC组高于C组(P<0.01)；TO、OE、OET组均低于OC组(P<0.05)。ISI：OC组低于C组(P<0.05)；OE、TO、OET组均明显高于OC组(P<0.01，表2)。

Fig.1Comparision of chemerin protein expression of rats among groups

GroupnChemerin concentration(μg/L)Blood sugar(mmol/L)ISIC516.692±1.54511.636±3.5680.395±0.019OC519.051±0.927**17.930±6.094**0.369±0.017*OE616.261±0.981##12.842±1.905#0.396±0.015##TO517.308±1.022#12.550±2.669#0.397±0.016##OET616.389±0.609##12.933±1.203#0.399±0.008##

C： Control group； OC： Obese control group； OE： Obese exercise group； TO： Turtle oil group； OET： Obese supplement of turtle oil combined with exercise group

*P<0.05,**P<0.01vsC group；#P<0.05,##P<0.01vsOC group

3 讨论

chemerin是近年来研究肥胖相关代谢疾病的热点之一。研究指出[10]，高脂膳食饲养大鼠的内脏脂肪组织中chemerin mRNA表达明显高于正常大鼠。肥胖大鼠内脏脂肪组织中chemerin蛋白质表达、血浆chemerin水平均高于自然生长大鼠[11]。运动能够减少肥胖鼠和瘦鼠的脂肪量、减低肥胖基因(ob)mRNA水平，运动增加能量消耗，使ob基因对能量消耗增加的反应性表达降低，使体重维持在一个相对稳定的水平[12]。相关研究发现，有氧运动干预后，高脂膳食大鼠内脏脂肪组织chemerin mRNA表达和蛋白质表达显著降低[13]。甲鱼油作为一种食用油脂，富含多种不饱和脂肪酸，尤其是二十二碳六烯酸(decosahexaenoic acid, DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)能够调节血脂、抗高血压、维持糖代谢的稳定，可以改善大鼠肝脏中相关基因mRNA表达量[14-15]。本研究发现，老年肥胖大鼠内脏脂肪组织chemerin mRNA和蛋白质表达呈现高于正常老年大鼠的趋势，差异无统计学意义，可能是由于大鼠样本数偏少、饲养方式和饲养环境等条件所导致，未来将进一步深入研究。运动与甲鱼油干预后，chemerin蛋白质表达明显低于单纯运动干预和单纯甲鱼油干预，提示运动结合甲鱼油的干预效果更明显，二者有明显的协同性。

肥胖患者有糖、脂代谢异常，血糖水平高于正常人，且维持血糖平衡的能力降低，血糖下降速度变慢，胰岛素分泌增多[16]。有规律的运动和低脂膳食干预能有效促进机体糖的利用和转化，降低血糖和血脂水平，显著提高其ISI，改善内分泌和新陈代谢[17-19]。本研究发现，老年肥胖大鼠血浆chemerin浓度和血糖水平明显升高，ISI降低。通过运动和/或甲鱼油的干预，血浆chemerin浓度和血糖水平明显下降，ISI改善；但运动和甲鱼油的干预无协同性。说明运动和/或甲鱼油干预能够明显改善老年肥胖大鼠血浆chemerin水平，是否通过血浆chemerin水平的降低来改善ISI，进而降低血糖水平尚需进一步研究。

综上所述，老年肥胖大鼠血浆chemerin浓度及血糖水平增高，胰岛素敏感性降低；运动结合甲鱼油能明显降低老年肥胖大鼠内脏脂肪组织chemerin蛋白质表达，降低血浆chemerin浓度及血糖水平，提高胰岛素敏感性。推测运动结合甲鱼油干预可能是改善老年肥胖和预防肥胖相关疾病的有效手段。