抗细胞趋化因子CCL21单克隆抗体处理对小鼠急性心肌梗死后左心室重构及心功能的影响*

蒋 易， 燕艳丽， 白建文

(同济大学附属东方医院急诊内科， 上海 200120)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是常见的冠状动脉心血管疾病，起病急、进展快，常伴有心律失常和心脏衰竭，病死率极高。炎症反应是AMI过程中的关键环节，梗死区内心肌细胞大量坏死可导致组织内急剧炎症反应，白细胞和单核细胞快速被募集并伴有大量细胞因子释放，最终导致心室扩张和心脏重构[1]。有效控制急性心肌梗死后趋化因子介导的炎症反应是当前治疗急性心肌梗死和提高梗死后心脏功能的关键靶点。

C-C家族趋化因子配体21(C-C chemokine ligand 21, CCL21)是细胞趋化因子C-C家族成员之一，能促进初始和效应T细胞迁移到炎症和感染部位。CCL21主要与C-C家族趋化因子受体7(C-C chemokine receptor 7, CCR7结合)，参与调节淋巴细胞归巢和进入次级淋巴组织。CCL21/CCR7广泛表达于成纤维细胞、平滑肌细胞核和内皮细胞等非淋巴组织，并参与了炎症调节、平滑肌细胞增殖和基质重塑等生物学效应[2]。炎症反应是导致心肌组织降解和细胞凋亡的关键，因此，及时有效地抑制心肌梗死后炎症反应对于预防心肌梗死后心室重塑和保护心脏功能有重要意义。本研究拟采用小鼠心肌梗死模型探讨抗CCL21单克隆抗体处理对急性心肌梗死后左心室重构及心功能的影响，旨在为预防心肌梗死后心室重构提供新思路。

1 材料与方法

1.1 建立小鼠急性心肌梗死动物模型

雄性C57 BL/6小鼠(8～12)周龄，体重(23～25) g，购自华中科技大学同济医学院动物中心实验动物中心，C57BL/6小鼠先随机分为假手术组，模型组和CCL21单抗干预组，实验过程中因麻醉手术等意外死亡的小鼠均不列入实验动物内，存活小鼠再进一步随机分为1、3、7和21 d亚组，每组8只。小鼠心肌梗死(myocardial infarction, MI)模型制作过程如下，在吸入麻醉状态下，于小鼠左侧第3、4肋间隙切开，暴露心脏，永久性结扎冠状动脉左前降支；假手术组只挂线不结扎冠状动脉，建模成功率为70%。分别在小鼠冠状动脉左前降支结扎后5 min和3 d后，假手术组和模型组静脉注射山羊抗小鼠Ig-G同型血清1.0 mg，CCL21单抗干预组静脉注射山羊抗小鼠CCL21单克隆抗体1.0 mg。

1.2 ELISA法检测血清CCL21、TNF-α和IL-6浓度

分别在小鼠冠状动脉结扎后的第1、3、7天，眼眶后静脉丛取血，血样静置2 h，2 500 r/min离心15 min，收集血清。采用美国BD公司小鼠CCL21、TNF-α和IL-6酶联免疫分析试剂盒，严格按照说明书操作，检测细胞因子浓度。

1.3 Western blot检测心肌组织CCR7、MMP-2和MMP-9的表达

分别在建模后第1、3和7天检测，每次每组检测8只。每次检测时提取心肌组织总蛋白质并定量，SDS-PAGE后冰浴转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。分别滴加抗β-actin单克隆抗体(1:1 000稀释)、抗CCR7多克隆抗体(1:500稀释)、抗MMP-2多克隆抗体(1:500稀释)和抗MMP-9多克隆抗体(1:500稀释)(购自Santa Cruz Biotechnology公司)，均4 ℃孵育过夜。清洗后，滴加1:4 000稀释的HRP标记的羊抗小鼠多克隆抗体(Abcam公司)，室温孵育2 h。按增强化学发光试剂(ECL)的使用说明配制发光底物工作液，显影、定影。用Image J软件对各蛋白质条带进行灰度扫描，以内参β-actin蛋白质为基准，计算CCR7、MMP-2和MMP-9的相对表达量。

1.4 心脏超声评价

冠状动脉左前降支结扎术后第7天和第21天，小鼠吸入麻醉，使用Sonos 4500小动物超声系统(Philips公司)行心脏超声检测(探头频率15～16 MHz)。探头经胸骨旁长轴获得左心室M型超声影像，分别测量左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)，左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)。心脏功能相关指标，包括左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)由仪器自动计算。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 急性心肌梗死对小鼠血清CCL21和心肌CCR7水平的影响

与假手术组小鼠相比，术后第1、3、7天急性心肌梗死模型组小鼠外周血中CCL21水平均显著增高(P<0.05，图1B)；心肌组织内CCL21受体CCR7的表达水平也显著增高(P<0.05，图1C)。

2.2 抗CCL21单克隆抗体处理对小鼠心肌梗死后血清炎性因子水平的影响

与假手术组小鼠相比，在急性心肌梗死1天后和3天后，模型组小鼠外周血中TNF-α和IL-6水平均显著增高(P<0.05)。急性心肌梗死1 d后，CCL21单抗干预组小鼠血清TNF-α和IL-6水平均显著低于模型组(P<0.05，图2)。

Fig.1Effect of AMI on serum levels of CCL21 and myocardial level of CCR7 (n=8)

AMI：Acute myocardial infarction；CCL21：C-C motif chemokine ligand 21；CCR7：C-C motif chemokine receptor 7.

*P<0.05,**P<0.01vssham-operated group

Fig.2Effect of anti-CCL21 monoclonal antibody treatment on serum levels of TNF-α and IL-6 (n=8)

TNF-α：Tumour necrosis factor-alpha；IL-6：Interleukin-6

*P<0.05vssham-operated group,#P<0.05vsmodel group

2.3 抗CCL21单克隆抗体处理对小鼠心肌梗死后7 d心肌MMP-2和MMP-9表达的影响

Fig.3Effect of anti-CCL21 monoclonal antibody treatment on the expression levels of myocardial MMP (n=8)

MMP2：Matrix metalloproteinase 2；MMP9：Matrix metalloproteinase 9

*P<0.05vssham-operated group;#P<0.05vsmodel group

Western blot检测结果表明，与假手术组小鼠相比，冠脉结扎7 d后小鼠心肌组织中MMP-2和MMP-9蛋白质表达水平均显著增高(P<0.05)。给予抗CCL21单克隆抗体处理可有效逆转MMP-9表达水平的增高(P<0.05)，但是对心肌MMP-2表达水平增高无明显影响。

2.4 抗CCL21单克隆抗体处理对小鼠心脏功能的影响

与假手术组相比，模型组小鼠在心肌梗死后7 d和21 d，LVEED和LVESD均显著增高，LVEF和LVFS均显著降低。与模型组相比，给予抗CCL21单克隆抗体处理有效降低了术后7 d和21 d组小鼠LVEED和LVESD水平；给予抗CCL21单克隆抗体处理显著提高21 d组小鼠左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短分数(LVFS)水平(表1)。

3 讨论

心肌梗死后心脏重构严重影响心脏收缩和泵血功能，是急性心肌梗死患者在恢复期面临的主要风险。梗死组织愈合主要取决于趋化因子介导的炎症反应，胶原增生形成的瘢痕最终替代坏死的心肌组织。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是促进梗死区和非梗死区细胞外基质降解的关键蛋白水解酶。其中，MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的一个重要成员，可降解Ⅳ型胶原等多种细胞外基质成分。MMP-9在AMI后早期主要由中性粒细胞分泌，随后主要由巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞等分泌[3]。MMP使心脏胶原降解亢进，引起梗死周边区炎症细胞的浸润，最终导致心肌梗死后的心室重构、室壁瘤形成以及心脏破裂。本研究发现，冠脉结扎7 d后小鼠心肌组织中MMP-2和MMP-9蛋白质水平均显著增高。给予抗CCL21单克隆抗体处理可有效逆转MMP-9表达水平的增高，但是对MMP-2表达增高无明显影响。

Tab. 1 Effect of anti-CCL21 monoclonal antibody treatment on cardiac function n=8)

LVEDD: Left ventricular end-diastolic diameter; LVESD: Left ventricular end-systolic diameter, LVEF: Left ventricular ejection fraction; LVFS: Left ventricular fractional shortening

*P<0.05vssham-operated group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

梗死后心肌组织由炎症期向增生期过渡的关键在于抑制过度炎症反应，促进细胞外基质瘢痕组织形成。最近研究发现，MMP在心血管疾病的炎症反应调节中发挥了关键作用，MMP的作用底物除了细胞外基质(extracellular matrix, ECM)外，还包括一系列细胞因子、生长因子及粘附分子等[4]。例如：MMP可以激活谷-亮-精氨酸基序(glutamate-isoleucine- arginine motif, ELR-motif)阳性的CXC家族趋化因子(C-X-C family of chemokine)，包括CXCL5，CXCL6和CXCL8等。此外，MMP还可激活TNF-α及白介素等炎性因子，研究还发现NOD2敲除小鼠可通过减少炎性趋化因子释放、单核细胞浸润及降低基质MMP-9活性，有效避免心肌梗死后心肌重塑和左心功能降低[5]。炎性因子TNF-α和IL-6水平升高，可激活成纤维细胞并诱导心肌间质纤维化，同时促进溶酶体酶和氧自由基的释放，加重心肌损伤。抑制心肌梗死后炎性因子TNF-α和IL-6水平，可以有效改善梗死后糖尿病大鼠远期的心功能[6]。本研究发现，给予抗CCL21单克隆抗体处理可有效逆转冠脉结扎7 d后MMP-9水平增高，小鼠外周血中炎性因子TNF-α和IL-6水平也显著低于假手术组。

心脏超声检查结果表明，抗CCL21单克隆抗体处理还有效逆转了小鼠心肌梗死后左心室扩张，LVEED和LVESD均显著低于假手术组小鼠。在抗CCL21单克隆抗体处理组小鼠，反映左心室功能的指标左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短分数(LVFS)均显著优于假手术组小鼠。基质金属蛋白酶MMPs是水解细胞外基质的蛋白裂解酶，急性心肌梗死后MMPs的表达和活性增强，可导致正常心肌胶原蛋白过度降解，并被纤维间质取代，导致心脏组织重构，心脏功能降低。临床研究表明，MMP水平是决定心肌梗死患者预后的关键因子，患者MMP水平越高，其临床预后越差[7]。动物实验证实，特异性敲除mmp-9基因的小鼠在急性心肌梗死后可刺激梗死后组织内血管形成，其左心室功能恢复显著优于对照组小鼠[8]。国内研究也发现，锌指蛋白转录因子ZFP580(zinc finger protein-580)通过下调MMP-3的表达调控心肌细胞外基质形成，从而影响了心肌缺血/再灌注损伤后心室重塑的过程[9]。本研究发现，尽管抗CCL21单克隆抗体处理可以有效逆转MMP-9水平增高，但对MMP-2水平增高则无明显影响，推测其他调节机制可能参与了心肌梗死后MMP-2水平调节。卢彦珍等发现，MMP-2释放和活性增高与心肌间质的破坏和心功能损害存在明显相关性，缺血/再灌注过程中体内氧自由基生成增加或清除不足导致心肌基质金属蛋白酶激活，使心肌胶原降解和破坏[10]。基于上述结果，我们认为抗CCL21单克隆抗体处理对梗死后心肌组织的保护效应可能与抑制梗死后MMP-9介导的炎症反应有密切关系，进而发挥保护左心室功能、防止梗死后心脏重构，但具体作用机制还有待进一步深入研究。

综上所述，本研究发现使用抗CCL21单克隆抗体处理可明显抑制急性心肌梗死后心肌MMP-9表达增高和炎症反应，起到保护梗死后心脏重构和提高心脏功能的作用。