芪山无糖颗粒对糖尿病前期大鼠瘦素和肿瘤坏死因子-α表达的影响

徐新鹏 朱岚 魏燕 侯鹏超 李迎新 洪郁芝

糖尿病前期是指血糖水平介于正常值与糖尿病诊断标准之间的一种糖代谢异常状态，糖尿病前期者是易发糖尿病的高危人群，绝大部分2型糖尿病患者被确诊糖尿病之前都经过糖尿病前期阶段。芪山无糖颗粒以健脾化湿、清热泻浊法立方，本科临床应用于糖尿病前期和糖尿病早期已达十年之久，取得了较好的疗效［1-2］。本研究在观察糖尿病前期大鼠采用芪山无糖颗粒干预后糖脂代谢变化的同时，进一步检测与胰岛素抵抗相关的因子TNF-α和瘦素（Leptin）水平，旨在为芪山无糖颗粒的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄雄性SPF级SD大鼠60只，体重（100±20）g，由上海西普尔-必凯实验动有限公司提供［SCXK（沪）2013-0016］。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心［SCXK（浙）2008-0115］。通过杭州市中医院动物护理和使用委员会审批。

1.2 实验药品 西药马来酸罗格列酮，由葛兰素史克（天津）有限公司生产，规格4mg/片。中药芪山无糖颗粒：由杭州市中医院医院制剂中心提供。配方：生黄芪746g、山药373g、茯苓746g、黄芩225g、黄连150g、绞股蓝373g、炒枳实300g、生山楂498g、川芎498g、葛根300g、苍术300g。取处方量药材，加水45L，煎煮2次，1h/次，合并煎液浓缩至含生药1g/ml，冷藏过夜，离心。取上清液稀释至含生药0.4g/ml，加热至60℃～70℃，加壳聚糖溶液（18g用2%醋酸溶液配成1%的浓度）1.8L，边加边搅拌，澄清剂加完后，继续保温搅拌30min，室温放置过夜，离心，滤液浓缩，真空干燥成浸膏粉。加乳糖101.2g，甘露醇50.6g，糊精50.6g，用70%乙醇湿法制成颗粒，60℃干燥，整粒，制成1kg。

1.3 实验仪器 血糖试纸及快速血糖仪均购自拜耳公司； AU2700全自动生化仪，日本OLYMPUS公司生产；Denley Dragon 酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司生产。

1.4 实验方法 高脂高糖饲料为普通饲料添加猪油、蛋黄粉、蔗糖、胆固醇加工后经过辐照消毒制作而成，其比例为普通饲料69.5%，猪油10%，蛋黄粉10%，蔗糖10%，胆固醇0.5%，由浙江省医学科学院委托加工。芪山无糖颗粒（复方饮片颗粒剂）由杭州市中医院中药制剂室自主研发。大鼠的剂量约为人使用剂量的6.25倍，60kg成人服用芪山颗粒15g/d，换算成1kg大鼠的用量为30×1/60×6.25=1.5625g。60kg成人一天服用的最大量罗格列酮为8mg，换算成1kg大鼠用量为8×1/60×6.25=0.833mg。本实验采用SD雄性大鼠，通过高脂高糖喂食制造糖尿病前期模型。普通饲料喂食2周适应环境后，随机分成6组：正常对照组（NC）、高脂高糖喂食的模型组（MC）、低剂量中药组（Z1）、中剂量中药组（Z2）、高剂量中药组（Z3）、罗格列酮组（X）。每组8只实验用鼠，体重组间差异无统计学意义（P＞0.05）。NC组采用普通饲料喂食，MC、Z1、Z2、Z3、X组采用高脂高糖饲料喂食；16周后 MC、Z1、Z2、Z3、X比NC的体重和餐后2h血糖同时出现显著性增高（p＜0.01），作为糖尿病前期造模成功。造模成功后，各组继续原饲料喂养得同时，并予以药物灌胃治疗。NC、MC组采用蒸馏水2ml/d灌胃，Z1、Z2、Z3组分别使用中药1.5625g/（kg·d）（等同于人的用量）、3.125g/（kg·d）（等同于人用量的 2 倍）、6.25g/（kg·d）（等同于人用量的4倍）灌胃，X组采用罗格列酮0.833mg/（kg·d）（相当于人的最大推荐剂量）灌胃。16周后行OGTT 试验，即禁食不禁水12h，测定空腹血糖后，以2g/kg灌胃50%葡萄糖，再测餐后2h血糖。抽取尾静脉血液用ELISA法检测空腹胰岛素和餐后2h胰岛素。抽取大鼠腹主动脉血液待检测血脂、TNF-α、leptin。其中血糖采用血糖试纸测量，测量之前以标准液校对。胰岛素（INS）、TNF-α、leptin采用ELISA检测法。血脂采用全自动生化仪检测。根据公式HOMA-IS =1/（FPG×FINS）计算胰岛素敏感性指数、根据公式HOMA-IR =FPG×Fins/22.5计算胰岛素抵抗指数。

1.5 统计学方法 采用SPSS17. 0统计软件包。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验。p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组别的Leptin、TNF-α及最后体重的比较 TNF-α结果提示，与NC组比较，MC组明显升高（p＜0.01）；药物组出现一定程度的恢复但不完全（p＜0.05或0.01）；与MC组相比，Z3、X组下降最为显著（p＜0.01）；而 Z3、X 组组间比较比无意义（P＞0.05）见表1。

表1 各组别的Leptin、TNF-α及最后体重的比较（x±s）

2.3 对糖脂代谢及体重的影响 FPG及2hPG提示，与NC组比较，MC组血糖明显增加（p＜0.01）；而药物干预组出现血糖减低，但中药组未能恢复正常对照组水平（p＜0.01）；与MC组比较，Z3、X组血糖明显减低（p＜0.01），Z3、X 组效果优于 Z2（p＜0.05），Z3和X组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。TG结果提示，与NC组比较，MC组明显增加（p＜0.01）；药物组有一定下降，以Z3组最为明显（P＞0.05）；与MC组比较，中药、西药组均出现显著下降（p＜0.01）；与 Z1比 较，Z3降 低 TG效 果 最 佳（p＜0.01）；Z2、Z3、X组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。LDL结果提示，与NC组比较，MC组明显增加（p＜0.01）；药物组出现不同程度的降低，以X组最为明显（P＞0.05）；与MC组比较，中药组均有下降，以Z3效果最为显著（p＜0.05），X组效果显著（p＜0.01）；Z3与X组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组别中血脂和血糖的比较

表2 各组别中血脂和血糖的比较

注：与NC组比较，*p＜0.05，#p＜0.01；与MC组比较，▲p＜0.05，△p＜0.01；与Z2组比较，★p＜0.05；与Z1组比较，■p＜0.01

组别 样本量 TG（mmol/L） LDL（mmol/L） FPG（mmol/L） 2hPG（mmol/L）NC组 8 0.301±0.137 0.224±0.053 4.71±0.55 6.78±0.51 MC组 8 1.088±0.222# 0.534±0.132# 5.93±0.33# 8.88±0.43#Z1组 8 0.684±0.191#△ 0.553±0.197# 5.69±0.22# 8.54±0.85#Z2组 8 0.626±0.074#△ 0.469±0.071# 5.65±0.31# 7.8±0.53#△Z3组 8 0.438±0.155△■ 0.406±0.112#▲ 5.23±0.18#△ 7.19±0.43△★X组 8 0.523±0.187*△ 0.331±0.086△ 5.01±0.32△ 7.14±0.38△★

2.4 各组别中胰岛素水平和HOMA指数的比较 HOMA-IR结果显示，与NC组比较，MC组胰岛素抵抗指数明显增加（p＜0.01）；药物组出现不同程度的降低，Z3、X组最为明显（P＞0.05）；与MC组相比，Z3、X组显著降低（p＜0.01）；而Z3与X组之间无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组别中胰岛素水平和HOMA指数的比较

表3 各组别中胰岛素水平和HOMA指数的比较

注：与NC组比较，*p＜0.05，#p＜0.01；与MC组比较，▲p＜0.05，△p＜0.01；与Z1组比较，■p＜0.05

组别 样本量 FIN（mU/L） 2hFIN（mU/L） HOMA-IR HOMA-IS NC 8 3.4049±0.6526 2.0465±1.0044 0.7159±0.1747 1.4722±0.3682 MC 8 5.0866±0.7629# 5.5497±0.9865# 1.3376±0.1977# 0.761±0.1045△Z1 8 5.0522±0.653# 3.8867±0.9663#△ 1.2788±0.1865# 0.7973±0.1207*Z2 8 4.9564±0.3004# 3.8063±1.0854#△ 1.2429±0.0735# 0.807±0.0469*Z3 8 3.4993±0.6665△ 2.7281±0.9247△■ 0.8133±0.1597△ 1.2805±0.2987▲X 8 3.5385±1.0995△ 2.8144±1.0313△■ 0.8003±0.2951△ 1.4116±0.5191

3 讨论

糖尿病前期主要病理生理特点是外周组织胰岛素抵抗所导致的人体对葡萄糖的转化利用和耐受性降低［3］。从中医学角度而言，人体机能较大程度上取决于脾气的运化功能。因脾为后天之本，气血生化之源，与胃共同完成人体对饮食的消化和吸收过程。当人体先天不足，脾气素虚而运化之力弱；或思虑或劳倦过度，脾气滞结，或脾气内耗，可致脾虚不运；或饮食失节，长期饮食肥甘，醇酒厚味，又乏运动，食热内积，化火而耗水谷伤阴津。

芪山无糖颗粒由生黄芪、淮山药、茯苓、苍术、黄芩、黄连、绞股蓝、炒枳实、生山楂、川芎、葛根等药物组成。方中以生黄芪、淮山药为君药，补气健脾培本；并臣以茯苓、苍术渗湿燥湿，佐以黄芩、黄连、绞股蓝清热去浊；枳实、山楂理气消食、化痰消积；川芎、葛根清热生津、行气活血。上方共奏益气健脾、清热化湿去浊之效，使脾气健运而水津四布，痰浊内热清而肥甘中满消。在现代实验及临床研究中［4-6］，发现方中药物通过众多途径发挥降糖降脂，增加胰岛素分泌及敏感性，改善胰岛功能等作用。

本实验中，经高脂饲料喂食后的大鼠与正常喂食后的正常大鼠比较，在体重和血脂明显升高的同时，血糖较正常对照组明显升高，但尚未达到通常STZ诱导的典型糖尿病大鼠模型（血糖＞16.7mmol/L）的标准。并且，血浆胰岛素水平较正常大鼠明显升高，胰岛素抵抗指数升高，胰岛素敏感指数下降。因此，本实验高脂饲料喂食后的大鼠基本符合2型糖尿病前期的大鼠模型。

本研究结果显示，芪山无糖颗粒与罗格列酮均能不同程度降低模型组的空腹血糖及餐后2h血糖，明显改善脂代谢紊乱。且与罗格列酮对照组比较，芪山无糖颗粒更有干预体重增加的优势。而且，在糖脂代谢改善的同时，空腹胰岛素和餐后2h胰岛素均下降，胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）在中药各剂量组和罗格列酮组也随之下降，胰岛素敏感指数（HOMA-IS）均升高。表明芪山无糖颗粒能明显改善糖尿病前期大鼠模型的血糖水平和脂代谢紊乱，而糖脂水平的改善是与降低2型糖尿病主要病机，即胰岛素抵抗程度相关。

脂肪组织是一个重要的内分泌器官，其可以分泌多种脂肪因子如TNF-α、leptin等。研究发现［7］，TNF-α在肥胖鼠脂肪细胞中的过度表达和胰岛素受体的酪氨酸激酶活性增加，导致胰岛素抵抗。另外，TNF-α可通过抑制脂蛋白脂酶（LPL）活性，促进脂肪细胞内脂肪分解而升高FFA，加重胰岛素抵抗。本研究结果表明，芪山无糖颗粒使糖尿病前期大鼠增高的TNF-α有一定程度的下降。

肥胖者leptin血浆含量及脂肪组织表达量均增加。体外研究表明，脂肪细胞体积与数目的增加与leptin、TNF-a的表达水平呈正相关，存在leptin抵抗及TNF-a抵抗状态［8］，反馈性的增加其表达和分泌，可促进体重增加。Leptin可进一步抑制胰岛素信号转导途径，加重胰岛素抵抗。本研究结果显示，MC组经芪山无糖颗粒干预后，增高的Leptin呈剂量依赖性的下降。

综上所述，芪山无糖颗粒可能是通过降低糖尿病前期大鼠TNF-α和leptin水平的作用机制，从而达到缓解糖尿病前期大鼠高胰岛素血症，增加糖尿病前期大鼠胰岛素敏感性，最终实现纠正糖尿病前期大鼠的糖代谢及脂代谢紊乱的作用。