霍山石斛姜黄葛根胶囊安全性研究

李 志，王升贵，唐 川

(九仙尊霍山石斛股份有限公司，上海闵行 201199)

霍山石斛姜黄葛根胶囊是以霍山石斛提取物、姜黄素、葛根提取物为原料，以淀粉、硬脂酸镁为辅料，经制粒、干燥、混合、填充等工艺加工制备而成的具有增强免疫力、对化学性肝损伤有辅助保护作用的保健食品。霍山石斛又称霍斛、米斛、霍石斛等，是皖西地区重要的名贵药材，属国家一级保护植物，《百草镜》记载：“石斛，出自六安州及颍州府霍山县，称霍山石斛，最佳”[1]。对于霍山石斛安全性，李滨等[2]对霍山石斛毒理学的研究结果表明，霍山石斛无急性毒性、亚急性毒性与致突变作用，霍山石斛最大观察到的有害作用剂量(NOAEL)为20.0 g/kg。李然等[3]对姜黄素进行毒理学试验表明，姜黄素大/小鼠经口急性毒性试验属实际无毒物质，未见潜在的致突变、致微核及致畸形作用。沃兴德等[4]对通过80 d长期毒性试验结果表明,在试验剂量内姜黄素对肝肾功能无影响、对10项血液生化指标、8项血液学指标无显著影响。詹键等[5]对葛根进行评价，结果表明小鼠经口LD50在20 g/kg，属于无毒级，未有致突变、致微核及致畸形作用。该品配方3种主要原料的原药材“霍山石斛、姜黄、葛根”无“十九畏”和“十八反”等配伍禁忌。为了验证霍山石斛姜黄葛根胶囊的安全性，笔者依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)[6]毒理学检验方法进行安全性评价研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1样品。霍山石斛姜黄葛根胶囊，硬胶囊剂，由九仙尊牌霍山石斛股份有限公司生产。保质期24个月，成人推荐量为1.0 g/(人·d)(体重按60 kg计)。

1.1.2实验动物。健康成年清洁级ICR小鼠由扬州大学比较医学中心提供，生产许可证号SCXK(苏) 2012-0004；SPF健康级离乳SD大鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK (沪)2013-0016。

实验动物饲养环境：温度20～25 ℃，相对湿度：40%～70%。实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2012-0041。辐照鼠用灭菌饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，合格证：苏饲审(2008)01008。

1.1.3试验菌株。鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102以及S-9均来源于复旦大学公共卫生学院。

1.1.4仪器。DT-1000电子天平、7100型全自动生化分析仪，SIEMENS ADVIA 2120i血液分析仪，OLYMPUS显微镜，BAKER SG-603生物安全柜，电热恒温培养箱，SX-700高压灭菌器，KYC-100型恒温摇床。

1.2方法

1.2.1急性毒理试验。采用最大耐受量法，受试样品给予剂量为15 000 mg/kg。受试样品用无菌水配制，最大浓度为0.75 g/mL，按最大灌胃量(20 mL/kg)，一次灌胃给样。给样后连续观察14 d，记录中毒表现及死亡情况。

1.2.2Ames试验。选鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102，经鉴定合格后进行试验。试验设5 000、1 000、200、40和8 μg/皿5个剂量组，每个剂量组做3个平皿。阳性物：不加S-9者为2,4,7-三硝基芴铜(TA97、TA98)，甲基磺酸甲酯(TA100、TA102)；加S-9者为2-氨基芴(TA97、TA98、TA100)，1,8-二羟基蒽醌(TA102)，设阴性对照组(未处理对照组和溶剂对照组)。采用标准平板掺入法进行培养，计数每皿回变菌落数。

1.2.3小鼠骨髓细胞微核试验。采用30 h受试物法。ICR种清洁级小鼠50只，按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半。受试样品人可能摄入量的100倍为1 667 mg/kg，最高剂量设为10 000 mg/kg，设2 500、5 000、10 000 mg/kg 3个剂量组、阴性对照(无菌水，20 mL/kg灌胃)、阳性对照组(环磷酰胺，40 mg/kg腹腔注射)。取胸骨常规制片、镜检，观察含微核的骨髓嗜多染红细胞(PCE)数并计算微核发生率，结果采用Pisson分布U检验进行统计。并计算骨髓嗜多染红细胞与成熟红细胞(NCE)比值(PCE /NCE)。

1.2.4小鼠精子畸形试验。选用ICR种清洁级性成熟雄性小鼠25只，按体重随机分为5组，每组5只。受试样品人的可能摄入量的100倍为：1 667 mg/kg，最高剂量设为10 000 mg/kg，设2 500、5 000、10 000 mg/kg 3个剂量组、阴性对照组(无菌水，20 mL/kg灌胃)，每天1次，连续5 d。于首次给样后的第35天处死动物，取两侧附睾精子滤液按常规制片、镜检。每鼠计1 000个结构完整的精子，计算精子畸形发生率，结果采用秩和检验进行统计处理。

1.2.530 d喂养试验。按人体推荐量的30、65和100倍设计，受试样品掺入饲料中，摄食量按大鼠体重的10%折算，喂养30 d后，根据动物平均体重和平均摄食量，计算实际剂量雌性为0.56、1.23、1.88 g/(kg·d)(低、中、高)，相当于人体推荐量的34、74、113倍，雄性为0.59、1.27、1.95 g/(kg·d)(低、中、高)，相当于人体推荐量的35、76、117倍。对照组为基础饲料。动物自由进食饮水。

每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量，计算每周及总的食物利用率。各组动物给予各剂量组饲料连续喂养30 d后，隔夜禁食，逐只称重后，进行血液学指标和血液生化指标、脏器指数、病理学检查。

用SPSS软件对各试验原始数据进行方差齐性检验，满足方差齐要求的数据用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理，对方差不齐的数据资料采用秩和检验进行处理。

2 结果与分析

2.1急性经口毒性试验试验观察期间，各组动物饮食和活动正常，生长良好，未见任何中毒表现及死亡。霍山石斛姜黄葛根胶囊对小鼠体重和死亡数的影响见表1。由表1可见，霍山石斛姜黄葛根胶囊雌雄小鼠急性经口最大耐受剂量(MTD)大于15 000 mg/kg，属于无毒级。

表1 霍山石斛姜黄葛根胶囊对小鼠经口毒性的影响

2.2Ames试验由表2可见，各剂量组回变菌落数均未超过阴性对照组回变菌落数的2倍，亦无剂量-反应关系。即霍山石斛姜黄葛根胶囊对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株试验菌株，在加与不加S-9时，均未见有致基因突变作用。

表2 霍山石斛姜黄葛根胶囊Ames试验回变菌落数

注：**表示超过阴性对照组菌落数2倍以上

Note: * * indicates more than 2 times the colony count in the negative control group

2.3小鼠骨髓细胞微核试验由表3可见，各剂量组微核率与阴性对照组相比无显著性差异(P>0.05)，而阳性对照组则显著高于阴性对照组(P<0.01)。未见霍山石斛姜黄葛根胶囊对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成及嗜多染红细胞与成熟红细胞比值(PCE/NCE)产生影响。

表3 霍山石斛姜黄葛根胶囊对小鼠骨髓细胞微核发生率和PCE/NCE的影响(n=5)

注：**表示与0 mg/kg组比较，P<0.01

Note:* * indicates that there is a significant difference between the positive control group and the negative control group (P<0.01)

2.4小鼠精子畸形试验由表4、5可见，各剂量组精子畸形率与阴性对照组比较，无显著性差异(P>0.05)，而阳性对照组小鼠精子畸形率与阴性对照组比较有显著提高(P<0.01)。因此霍山石斛姜黄葛根胶囊对小鼠精子畸形率未产生影响。

2.530d喂养试验

2.5.1霍山石斛姜黄葛根胶囊对大鼠一般表现、体重、食物利用率的影响。在大鼠30 d喂养期间，各组动物一般表现和行为均未见明显异常、无中毒表现、无死亡。由表6可见，雌雄大鼠各剂量的体重与 0 g/(kg·d)组比较，差异无统计意义(P>0.05)；经口给样30 d后，各剂量组动物每周增重、进食量、食物利用率与0 g/(kg·d)组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表4霍山石斛姜黄葛根胶囊对小鼠精子畸形率的影响(n=5)

Table4EffectofDendrobiumhuoshanensecurcuminpuerarincapsuleonspermdeformityrateinmice(n=5)

剂量Dosage mg/kg受检精子数The number of tested sperm总畸形数Total deformity number畸形率Malformation rate∥%05 0001062.1±0.42 5005 0001082.2±0.45 0005 000951.9±0.310 0005 0001032.1±0.340 mg/kg (环磷酰胺)40 mg/kg cyclophosphamide5 0004118.2±0.9**

注：**表示与0 mg/kg组比较，P<0.01

Note:* *indicates that there is a significant difference between the positive control group and the negative control group (P<0.01)

表5 霍山石斛姜黄葛根胶囊对小鼠精子畸形类型及比例的影响

2.5.2霍山石斛姜黄葛根胶囊对大鼠血液学指标的影响。各组大鼠喂养30 d后，进行血液学指标测定。由表7可见，雌雄各项指标与0 g/(kg·d)组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5.3霍山石斛姜黄葛根胶囊对大鼠血液生化指标的影响。由表8可见，1.23 g/(kg·d) 组雌性大鼠血清谷丙转氨酶水平与0 g/(kg·d)组比较虽有统计学差异，但数值均在正常范围内，且无剂量-反应关系，不认为具有不良生物学意义；其他剂量组的各项指标与0 g/(kg·d)组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表6 霍山石斛姜黄葛根胶囊对大鼠体重增加、进食量、食物利用率的影响

表7 霍山石斛姜黄葛根胶囊对大鼠血液学指标的影响

表8 霍山石斛姜黄葛根胶囊对大鼠血生化的影响

接下表

2.5.4大体病理及病理学检查

2.5.4.1霍山石斛姜黄葛根胶囊对大鼠脏器重量的影响。经口给样30 d后，测量各组大鼠重要器脏的绝对重量及相对重量(器脏重/体重)。由表9可见，各剂量组各项指标与0 g/(kg·d)组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表9 霍山石斛姜黄葛根胶囊对大鼠脏器重量的影响

2.5.4.2病理学检查。各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常改变。

对0 g/(kg·d)组雌性大鼠10例，0 g/(kg·d)组雄性大鼠10例，1.88 g/(kg·d)组雌性大鼠共10例，1.95 g/(kg·d)组雄性大鼠10例进行镜检，结果如下：① 肝脏。肝小叶结构清晰，肝索排列整齐；肝细胞大小基本一致，细胞核大小均一，核膜、核仁清楚，细胞质染色均匀。0 g/(kg·d)雌性组肝细胞轻度脂肪变性3例；0 g/(kg·d)雄性组肝细胞轻度脂肪变性1例，门管区轻度炎细胞浸润3例；1.88 g/(kg·d)雌性组肝细胞轻度脂肪变性2例，门管区轻度炎细胞浸润2例；1.95 g/(kg·d)雄性组肝细胞轻度脂肪变性1例，肝灶性轻度血肿1例。②肾脏。肾皮、髓质接线清楚，肾单位结构正常，肾小球无炎性改变、纤维化、玻璃样病变等变化，肾小管亦未明显病变。③脾脏。红、白髓清楚，中央动脉位居脾小体中央，小体无明显萎缩，脾窦扩张，脾小梁正常。④胃、十二指肠。表面黏膜正常，无炎性改变和糜烂、溃疡形成。黏膜下、肌层、浆膜层均无炎性改变。⑤卵巢(雌性组)。卵巢内可见不同发育阶段的卵泡及排卵后形成的黄体或白体。⑥睾丸(雄性组)。睾丸曲细精管由支持细胞及上皮细胞、初级、次级精母细胞构成，精细胞发育正常。

综上，霍山石斛姜黄葛根胶囊不同剂量给予大鼠30 d后，受试动物一般情况良好；血液学指标及生化指标均在正常范围；各器脏病理学组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)之30 d喂养试验，给予动物人体推荐剂量100倍

(实际剂量雌性为113倍,雄性为117倍)的九仙尊霍山石斛姜黄素葛根胶囊，未观察到有害作用。

3 结论

急性毒性试验结果表明，霍山石斛姜黄葛根胶囊小鼠急性经口MTD大于15 000 mg/kg，属于无毒级；Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验均为阴性，表明霍山石斛姜黄葛根胶囊无致基因突变作用，无致染色体畸变及生殖细胞遗传毒性；30 d喂养试验结果表明，霍山石斛姜黄葛根胶囊对动物的生长发育、造血功能、肝肾功能均无损害作用。综上，霍山石斛姜黄葛根胶囊安全，无明显的毒副作用，无致畸致突变作用。

霍山石斛产业近几年得到了较大的发展，已成长为霍山的支柱型产业。国务院在《中药材保护和发展规划(2015—2020年)》[7]中提出“突破濒危稀缺中药材繁育技术，发展中药材现代化生产技术，加强中药材综合开发利用”，而纵观霍山石斛市场，仍以初加工产品为主，其综合利用方面略显不足。该研究可为霍山石斛产品的深度开发提供参考依据。