黑龙江省海伦市一厂二矿及星火牧场革蜱伯氏疏螺旋体感染情况调查

2018-08-25秦立鑫

饲料博览 2018年8期

秦立鑫，张琦

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

蜱属于节肢动物门（Arthropoda）、蛛形纲（Arachinda）、蜱螨目（Acarina）、蜱亚目（Ixodides）、蜱总科（Ixodoidae），主要分硬蜱科（Ixodidae）、软蜱科（Argrasidae）、纳蜱科（Nuttalliellidae）。

蜱是专性吸血的体表寄生虫，严重损害动物的健康，被蜱叮咬，可造成中毒、咬伤、惊扰和失血。此外，蜱还是传播多种疾病，如莱姆病、森林脑炎、斑点热、野兔热、Q热、蜱出血热等，严重时，可直接或间接造成家畜和人类的死亡。

莱姆病（Lyme disease）又称为莱姆包柔体病或莱姆疏螺旋体病，是一种经由蜱传播的自然疫源性人兽共患病，因首次在美国康涅狄格州的莱姆镇发现因此而得名莱姆病。莱姆病主要因为蜱叮咬人、兽而传染，临床表现复杂多样，主要临床表现有皮肤慢性游走性红斑、脑膜炎、颅神经炎、神经根炎、关节炎、心脏炎等症状。病原体为伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi），可分为13个基因型。1982年，Willy等在美国首次从肩突硬蜱中分离出伯氏疏螺旋体，我国于1986年首次发现该病在位于黑龙江省海林县林区，之后相继报道的病原有狭义伯氏疏螺旋体（B.burgdorferi sensus stricto）、伽氏疏螺旋体（B.garinii）、阿氏疏螺旋体（B.afzelii）和法雷斯疏螺旋体（Borrelia valaisiana）共4个基因型。目前，我国至少存在6种不同基因型，包括阿氏疏螺旋体（B.afzelii）、伽氏疏螺旋体（B.garinii）、伯氏疏螺旋体（B.burgdorferi sens utricto）、法雷斯疏螺旋体（B.valaisiana）、西尼伽疏螺旋体（B.sinica）和长江疏螺旋体（B.yangtze）[1]。其中阿氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体和狭义伯氏疏螺旋体属于致病基因型。

该病呈现世界性分布，亚洲、欧洲、美洲、大洋洲、非洲的70多个已国家报道有该病发生，且发病区域在不断扩大，发病率呈上升趋势[1]。我国29个省（区、市）均有人患莱姆病的报道，而且每年新发病例高达上万余例。蜱是伯氏疏螺旋体的传播媒介和贮存宿主，蜱通过叮咬吸血将病原体传递给人类及动物。我国地域辽阔，蜱的种类繁多，并且因为环境等各方面因素不同，感染伯氏疏螺旋体情况也存在着较大的差异，因此探明蜱的种类在该病的防治中具有重要意义。

黑龙江省海伦市一厂二矿及星火牧场有着良好的生态环境，是重要的养殖园区。并且在此有被蜱叮咬的记录，因此了解蜱感染伯氏疏螺旋体的情况，为莱姆病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 采集样本

在黑龙江省海伦市一厂二矿及星火牧场周围采用布旗法采集游离蜱，鉴定分类后低温保存。

1.1.2 引物制备和方法

本试验采用嵌套PCR的方法检测伯氏疏螺旋体。需进行两轮PCR扩增。

第一轮扩增时使用的引物：23S N1和C1，扩增条件：94℃30 s，52℃30 s，72℃60 s，30个循环。

23S N1：5'-ACC ATA GAC TCT TAT TAC TTT GAC-3'

C1：5'-TAA GCT GAC TAA TAC TAA TTA CCC-3'

第二轮扩增时使用的引物：23S N2和5S CB，扩增条件：94℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，40个循环。

23S N2：5'-ACC ATA TCT TAT TAC TTT GAC CA-3'

5S CB：5'-GAG AGT AGG TTA TTG CCA GGG-3'

1.1.3 试验试剂

DNA 2 000 Marker、DNA聚合酶、引物、超纯水、TAE、EB、琼脂糖、dNTPs等。

1.1.4 主要仪器

振荡器；电泳槽（北京君意东方制造）；Hws24水浴锅（上海恒科仪器制造）；高速台式离心机；PCR仪（TaKaRa）；小型离心机（江苏海林市其林贝尔仪器制造）；紫外凝胶成像分析系统；电泳仪（六一牌）；微波炉（美的牌）。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取

DNA提取具体方法如下。

将蜱放入研钵内（研钵在每次使用时须确保以充分洗净，以防所提取的DNA被残留的DNA污染），然后小心的倒入液氮，充分研磨至无较大的碎片为止。

加入450 μL裂解液至研钵内与磨碎的蜱充分进行混合，用移液枪转移至干净的离心管中。

向离心管内加入20 μL蛋白酶K。加蛋白酶K时需要将枪头深入离心管中，充分混合均匀后，封口，将离心管置于56℃的水浴锅中过夜消化。

加450 μL苯酚（Tris平衡酚），注意苯酚分上下两层，吸下层（先将枪头插入再打气），简短摇晃20下，12 000 r·min-1离心10 min。

吸上层到新管，加225 μL氯仿及225 μL苯酚，摇晃20次，12 000 r·min-1离心10 min。

吸上层到新管，加450 μL氯仿。摇晃20次，12 000 r·min-1离心10 min。

吸上层到新管，加满无水乙醇（低温），-20℃冰箱保存20 h。

离心机预冷，12 000 r·min-1离心16 min，注意离心管放置角度一致。

将液体倒入新管中备用或弃掉，再将所得沉淀（DNA）。扣在干净的纸巾上，5 min晾干。

加入1 000 μL 80%酒精清洗，洗脱盐离子，震荡，混匀。

12 000 r·min-1离心5 min。重复沉淀及晾干。加入100 μL TE，室温环境放置约30 min，混匀。

1.2.2 PCR反应体系

PCR反应体系见表1。

表1 PCR反应体系（25 μL体系）

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳

取0.8 g琼脂糖放入锥形瓶中，后加入90 mL TAE，用微波炉加热至琼脂糖完全溶解，冷却至不感觉烫手时，再加入EB并充分的混和均匀，倒入准备好的板中，待胶凝好后，即可进行下一步操作。

取3 μL扩增产物加入点样孔中（勿点破凝胶），凝胶板中间的点样孔中加入Mark以作参照。

点完样之后，盖上电板盖并打开电泳仪，运行17 min（电泳条带跑至4～5线间）即可停止，进行照胶和记录数据。

2 试验结果

2.1 基因的扩增

以蜱DNA为模板，用特异性引物进行扩增。扩增后所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见226～266 bp的条带（图1、图2），与预期相符。

通过PCR的结果对黑龙江省海伦市一厂二矿及星火牧场的革蜱携带伯氏疏螺旋体情况进行统计，如表2所示，总检出率为53.13%。其中一厂二矿的检出率最高为64.58%；星火牧场的检出率为41.67%。

2.2 基因测序

将伯氏疏螺旋体阳性样本从中挑选9份送去DNA测序，部分测序结果见图3～6。

图3中108号革蜱伯氏疏螺旋体的基因序列经测序分析大小为229 bp，BLAST比对结果显示该蜱感染的伯氏疏螺旋体基因型与B.garinii基因型相识度为86%（图4）。

图1 一厂二矿革蜱的伯氏疏螺旋体部分检测结果

图2 星火牧场革蜱的伯氏疏螺旋体部分检测结果

表2 革蜱伯氏疏螺旋体的感染情况

图3 108号革蜱伯氏疏螺旋体的基因序列结果

图4 108号革蜱的BLAST对比结果

图5中142号革蜱伯氏疏螺旋体的基因序列经测序分析大小为225 bp，BLAST比对结果显示该蜱感染的伯氏疏螺旋体基因型与B.afzelii基因型相似度为99%（图6）。测序结果显示一厂二矿及星火牧场的革蜱均有感染阿氏和伽氏两种伯氏疏螺旋体基因型的情况，BLAST对比结果见表3。

图5 142号革蜱伯氏疏螺旋体的基因测序结果

图6 142号革蜱的BLAST对比结果

地点星火牧场一厂二矿伽氏疏螺旋体145 108、174、187阿氏疏螺旋体122、134、142、158 116

2.3 构建进化树

构以测序获得的伯氏疏螺旋体序列及GenBank上登录的相关伯氏疏螺旋与B.afzelii在同一进化分支上。表明这两个地点革蜱均携带了B.garinii和B.afzelii两种伯氏疏螺旋体，且携带率较高。如图7所示。

图7 进化结果

3 讨论

本次试验的96份样品中检测到51份含有伯氏疏螺旋体，总检出率为53.13%。检出率较高。这次试验表明一厂二矿及星火牧场的革蜱携带伯氏疏螺旋体，其中一厂二矿的革蜱携带率最高，其次是星火牧场。

早在1986年，在我国黑龙江省海林县林区便首次报道了莱姆病感染情况，并从中分离出伯氏疏螺旋体。在那之后，我国30多个省（直辖市、自治区）均有该病的报道出现，现已证实其中有19个存在莱姆病的自然疫源地。这一结果为该地区莱姆病的诊断防治提供了一定的依据，可以据此来帮助临床诊断。现已查明有多种野生动物、鸟类及家畜（牛、马、犬等）可以作为本病的宿主，维持该病在自然界中的存在和持续循环[1]。啮齿类动物是莱姆病的主要传染源，因其分布广、数量多、感染普遍。另外，鸟类的迁徙为远距离传播伯氏疏螺旋体创造了条件。因此，了解区域内伯氏疏螺旋体的感染情况，检测其宿主动物的带菌率是十分必要。对莱姆病传播媒介和储存宿主的控制有助于防控该病在我国的流行[2]。

生活在莱姆病自然疫源地及蜱虫存在地区的人有感染该病潜在可能。发病高峰期主要在夏末秋初。但是，由于地区之间存在着气候差异，因此不同地区莱姆病流行的时间也存在一定的差异。

试验结果表明，两地点革蜱感染伯氏疏螺旋体阿氏和伽氏两种基因型，这两种基因型均属于致病型。因此生活在牧场、林区及植被丰富地区的人应注意对莱姆病的预防，如被蜱叮咬且出现神经系统及皮肤病变者，应将莱姆病列入排查范围,以防漏诊、误诊。因此，场区应做好防控工作以保护工作人员和畜禽的安全，应采取一定的措施以防感染，注意定期杀虫。目前对莱姆病及其他蜱传播的疾病的主要预防措施是定期杀虫，主要运用杀虫剂来控制蜱的数量，但是这种方法会造成环境污染且容易出现抗药性，同时对人和动物存在一定的危险。目前有效的措施既杀虫剂的使用，有针对性的干预和个人的防护等措施相互结合起来，预防莱姆病和其他蜱传播的疾病。

本次试验为今后对其他地区伯氏疏螺旋体的研究，积累了宝贵的经验。