肾康注射液对缺血再灌注急性肾损伤小鼠的作用探讨*

章 韵 王海嵘 费爱华 高成金 郑运江

（上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200000）

急性肾损伤（AKI）是临床常见疾病，长期以来，缺乏有效的药物治疗手段。肾脏替代治疗（RRT）是目前主要的治疗措施［1-2］，但治疗时机及剂量仍不明确，且作为有创治疗，RRT存在风险大、治疗费用高昂等问题。且严重的AKI患者即使接受了RRT治疗，其90 d的死亡率仍高达40%［3］。而早期改善可逆损伤是AKI治疗的关键，因此迫切需要探寻一种创伤小、费用低且疗效显著的治疗方法。肾康注射液（SKI）是国家中药二类新药，由大黄、黄芪、红花、丹参等中药制成的复方制剂，近年来被广泛用于慢性肾脏病的治疗［4-6］，有文献指出它能改善肾纤维化、慢性氧化应激［7-8］，抑制肾小球系膜细胞及基质增生等［9-10］。一些临床实例观察到其可以改善急性肾损伤肾功能［11-12］，但缺乏证据说明它能否逆转肾脏急性病理损伤，因此我们拟通过制备不同损伤程度（轻、中、重度）的缺血再灌注急性肾损伤模型，观察SKI的干预作用并对机制做一简单探讨。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6小鼠 40只，雄性，质量 19～24 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号：5CXK（沪）2012-0002，饲养于屏障环境，自由进水进食。本研究获上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会批准。

1.2 试药与仪器

1）试药：肾康注射液，批号：国药准字Z20040110，自西安世纪盛康药业有限公司；肌酐、尿素氮、总超氧歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒自南京建成生物工程研究所；Cleved-Caspase3抗体、髓过氧化物抗体、免疫组化试剂盒自武汉谷歌生物科技有限公司；Triozol试剂自美国Invitrogen公司，Prime ScriptTMRT reagent试剂盒及SYBRTMPremix Ex TaqTM试剂盒自日本Takara公司。2）仪器：全自动酶标仪，美国Thermo公司生产；低温高速离心机，德国Eppendorf公司生产；高分辨显微镜，日本Olympus公司生产，实时荧光定量PCR仪7500，美国ABI公司。

1.3 造模与分组

C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、轻度损伤+SKI组、轻度损伤+普通生理盐水组（NS）组、中度损伤+SKI组、中度损伤+NS组、重度损伤+SKI组、重度损伤+NS组。空白对照组4只小鼠不造模，其余各组均为6只。C57BL/6小鼠购买后于屏障环境适应性饲养至8～12周，小鼠手术前晚禁食不禁水，参照文献进行轻、中、重损伤模型造模［13-15］，小鼠称质量后用10 mL/kg的5%水合氯醛麻醉，脱毛膏脱去腹部鼠毛，用宠物恒温加热毯，维持体温于（37±1）℃，肛温温度计监测肛温，消毒皮肤后从腹中线开口进入腹腔，腹腔撑开器撑开，小心拨开肠管，暴露双侧肾动脉，轻、中、重损伤造模分别予动脉夹对应夹闭双侧肾动脉15、25、45 min，然后移除血管夹，过程中可见肾脏由红色变为白色后逐渐呈暗红色，血流恢复后逐渐转为红色，术毕立即分别给予不同干预，最后用4号手术缝线逐层缝合关腹。24 h后小鼠麻醉下摘除眼球取血，然后颈椎脱臼处死，取右肾立即于4%多聚甲醛中固定，左肾保存于-80℃冰箱进行后续检测。

1.4 干预方法

空白对照组不做任何处理。轻、中、重度损伤造模+SKI组给予10 mL/kg肾康注射液。轻、中、重度损伤造模+NS组给予10 mL/kg的0.9%氯化钠注射液。各组用药时间均为24 h。

1.5 标本采集与检测

对各造模组进行肾功能及组织病理指标检测，之后选择肾功能及病理损伤改善组通过检测氧化应激、炎症、凋亡等指标对肾康注射液的药理机制进行进一步探究。

1.5.1 Scr、BUN及组织SOD、MDA检测 将取得的全血于高速离心机4℃，6000 r/min，离心20 min，取上清，用肌酐试剂盒（肌氨酸氧化酶法）及尿素氮试剂盒（脲酶法）按说明检测。取肾组织加生理盐水于组织研磨仪中研磨成匀浆后，用SOD试剂盒WST-1法）及MDA试剂盒（TBA法）检测。

1.5.2 肾组织切片HE染色 肾组织于4%甲醛固定1 d后进行脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察拍照，计数皮髓交界处坏死小管数及外髓部肾小管管型数，每张切片观察5个高倍镜视野（100倍）求平均值并统计。

1.5.3 肾组织切片免疫组织化学染色 取石蜡切片于不同浓度梯度二甲苯、乙醇中逐级脱蜡至水，过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，微波法修复抗原，血清封闭后滴加Cleved-Caspase3抗体（1∶100稀释）或髓过氧化物酶抗体（1∶100稀释）于4℃冰箱过夜，洗涤后加二抗，室温孵育60 min，再次洗涤，DBA显色，自来水冲洗终止反应，苏木素复染，冲洗，中性树脂封片，显微镜镜下观察拍照。凋亡评分标准：免疫组化切片上凋亡小管占总肾小管数比例：＜25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，＞75%计4分，观察5个高倍镜（×100倍）视野求平均值并统计。

1.5.4 实时聚合酶链反应（PCR）检测炎症因子表达

用Trizol试剂提取肾组织总RNA，用Prime ScriptTMRT reagent试剂盒，根据试剂盒说明进行逆转录，并将逆转录产物作为模版与SYBRTMPremix Ex TaqTM试剂盒按步骤在实时荧光定量PCR仪上反应。以β-actin为内参，评估各基因的扩增效率。待测基因的相对定量计算公式为 2-△△ct［△△Ct=（Ct样本目的基因-Ct样本β-actin）-（Ct空白对照目的基因-Ct空白对照 βactin）］，并以 2-△△ct统计量进行统计分析。 PCR 引物序列 ：iNOS forward：GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA，reverse：GTGGACGGGTCGATGTCAC；IL-6 forward：AGTCCGGAGAGGAGACTTCA，reverse：CAGTGCATCA TCGCTGTTCAT；β-actin forward：CATCCGTAAAGACC TCTATGCCAA，reverse：ATGGAGCCACCGATCCACA。

1.6 统计学处理

应用SPSS18.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组之间比较采用独立样本t检验或Nonparametric Tests；多组比较，若满足正态性及方差齐性，采用单因素方差分析（ANOVA），组间比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组Scr和BUN水平比较

见表1。夹闭双侧肾动脉 15 min、25 min、45 min对应的损伤模型，各造模组血清肌酐水平对比空白组均显著增高（P＜0.05）；且各损伤模型组之间肌酐水平存在明显差异，符合轻、中、重损伤造模要求（P＜0.05）。轻度损伤造模+SKI组的Scr与轻度损伤造模+NS组比较，明显下降（P＜0.05）；中度损伤造模+SKI组的Scr均数对比下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。但BUN之间无明显差异 （P＞0.05）。重度损伤造模+SKI组比重度损伤造模+NS组，虽然Scr和BUN均有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组Scr和BUN水平比较（±s）

表1 各组Scr和BUN水平比较（±s）

与相应程度损伤造模+NS组比较，*P＜0.05；与空白对照组比较，△P＜0.05

组 别 n Scr（μmol/L） BUN（mmol/L）空白对照组 4 28.07±8.36 2.60±0.33轻度损伤造模+SKI组 6 92.28±12.90* 30.61±2.10轻度损伤造模+NS组 6 156.17±38.37△ 30.44±6.84中度损伤造模+SKI组 6 165.91±24.11* 28.72±2.84中度损伤造模+NS组 6 279.03±46.74△ 31.17±1.99重度损伤造模+SKI组 6 299.22±40.74 38.99±2.67重度损伤造模+NS组 6 339.01±25.99△ 39.10±1.26

2.2 各组肾组织病理损伤比较

见图1。在空白对照组HE切片上可见肾小管间排列紧密、小管结构完整、上皮细胞呈高柱状，而各造模组中则均可见肾小管断裂、小管上皮细胞肿胀、空泡变性或扁平样变、刷状缘脱落、病理管型形成等。轻度损伤造模+SKI组在皮髓交界处少见坏死肾小管，轻度损伤造模+NS组则出现少量坏死小管。

中度、重度造模呈现大面积坏死，在HE切片上表现为均质状伊红染色，细胞核消失；且髓质部有病理管型形成。但在中度损伤中，中度损伤造模+SKI组坏死小管数为31.00/HP，与中度损伤造模+NS组的坏死小管数41.67/HP，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时中度损伤造模+SKI组髓质部病理管型为6.33/HP，中度损伤造模+NS组髓质部病理管型为26/HP，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 各组肾组织病例损伤比较 （HE染色，200倍）

2.3 轻度损伤组及空白对照组组织氧化应激水平比较

见表2。实验通过对比肾功能及组织病理损伤改善情况，得出肾康注射液可以改善轻、中度的肾损伤，而对重度损伤无明显作用，在此基础上选取有治疗作用的一组模型对其药理作用进行进一步探究。通过检测总SOD及MDA水平以反应肾组织氧化应激水平，轻度损伤+SKI组SOD值 较轻度损伤+NS组增高，差异有统计学意义；MDA值则明显下降（P＜0.01）。

表2 轻度损伤组及空白对照组SOD和MDA水平比较（±s）

表2 轻度损伤组及空白对照组SOD和MDA水平比较（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与轻度损伤造模+NS组比较，△P＜0.01。 下同

组 别 n SOD（U/mg） MDA（nmol/mg）空白对照组 4 120.99±5.98 3.39±0.35轻度损伤造模+SKI组 6 57.43±2.64**△ 6.82±2.20*△轻度损伤造模+NS组 6 33.01±6.00** 13.11±1.67**

2.4 轻度损伤组及空白对照组组织中性粒细胞浸润及炎症因子表达比较

见图2，表3。在免疫组化切片中观察到轻度损伤组术后给予SKI治疗的肾脏组织切片棕色点较少，表示更少的中性粒细胞浸润。同时检测了相关炎症因子的表达，发现iNOS及IL-6表达同时下降，且差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

图2 轻度损伤组及空白对照组组织中性粒细胞浸润（免疫组化染色，200倍）

表3 轻度损伤组及空白对照组炎症因子表达比较（2-△△ct，±s）

表3 轻度损伤组及空白对照组炎症因子表达比较（2-△△ct，±s）

组 别 n IL-6 iNOS空白对照组 4 1.02±0.05 0.98±0.07轻度损伤造模+SKI组 6 4.05±1.78*△ 1.90±0.35△轻度损伤造模+NS 组 6 7.87±1.24** 4.52±1.40**

2.5 轻度损伤组及空白对照组凋亡肾小管比较

见图3，表4。Clevaved-caspase-3是凋亡执行酶，本实验将其作为细胞凋亡指标［16］，免疫组化染色切片上可见细胞凋亡主要集中在外髓部位。空白对照组凋亡评分为1分，轻度损伤+SKI组评分为 （1.90±0.39）分，与上轻度损伤+NS组凋亡评分（2.45±0.10）分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 轻度损伤组及空白对照组肾小管凋亡比较（免疫组化染色，200倍）

3 讨 论

急性肾损伤（AKI）可进展为急性肾衰竭或尿毒症，严重危害人们的健康。根据2012年的改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）标准［17］，将 AKI 定义为 48 h内血清肌酐绝对值升高≥26.5 μmol/L或1周内较基础值升高 1.5倍或尿量<0.5 mL/（kg·h）超过 6 h。缺血后温复流是经典的急性肾损伤模型，损伤同样集中与肾小管，且根据缺血时间的不同呈现轻、重不一的损伤。本实验在参考文献的基础上调整双侧肾动脉夹闭时间制备不同损伤程度的小鼠模型，并在损伤24 h后观察各指标，有文献指出缺血再灌注损伤24 h时为损伤较严重时间点［18］。在轻度、中度损伤模型组中SKI干预后小鼠Scr下降，提示肾功能的改善，这种血清肌酐的下降在临床病人中同样也观察到，但是否存在肾脏病理损伤的逆转，临床病例很难获取肾组织标本以供进一步探究，而在小鼠模型中可以进行进一步研究。

不同时长缺血组HE切片上呈现出不同程度的损伤，在轻、中度模型组中SKI干预后可见肾小管的坏死情况改善，且这种改善量化具有统计学差异。而重度损伤模型出现大面积坏死，SKI干预与NS干预间无差异，同样Scr值也无差异，这提示药物作用的局限性，在较严重的患者中有必要及时采取更有效的治疗措施。

据此，笔者得出肾康注射液可以改善缺血再灌注肾损伤的小鼠的肾功能并部分逆转肾脏病理损伤，并在此基础上选择有所改善的模型组做了进一步的机制探究，肾脏缺血时组织细胞因供氧供能不足发生损伤，当血流恢复时中性粒细胞等急性期炎症细胞也随之进入组织，组织呈现出高氧化应激状态，活性氧、炎症因子、ATP缺乏等因素又继续加重缺血后损伤。因而缺血再灌注损伤是一个较复杂的过程，实验同时选取了几组指标观察SKI能否改善这一损伤过程。在组织SOD及MDA的检测中SKI干预组体现了较低的氧化应激水平，且中性粒细胞的浸润也较少，文中给出了代表性的对比结果，同时我们观察到中性粒细胞主要浸润在坏死组织（切片上呈均质无结构染色）周围，这与SKI干预组呈现较少的坏死小管一致。此外我们检测了肾组织炎症因子的表达，其中iNOS及IL-6的表达有统计学差异，而iNOS及IL-6是急性期促炎因子，可加重炎症反应。同时在肾小管凋亡也有所改善，而凋亡是小管死亡的不同形式，并与小管新生相关。

但是实验同时检测了各模型组BUN的值，SKI干预后均无改善，这可能与影响BUN的因素较复杂有关，Sik Lee等一项同样通过缺血再灌注损伤造模的实验中，予保护性干预后，Scr改善同时同样未见BUN改善［19］，且KDIGO标准中也未将BUN纳入SKI诊断及分层标准。

综上，我们实验从组织病理等角度证实SKI可以逆转一定程度的急性肾损伤，同时也回答了针对较严重的损伤其作用有限，这提示在临床工作中应及早干预阈值，及早行RRT治疗。