壳寡糖通便功能的研究

梁宇轩，欧阳冬梅，王达，陈咏春，刘焕，贺永健，庄新栋，黄日明，孙远明，王弘

（华南农业大学食品学院，广东省食品质量与安全重点实验室，广东广州510642）

便秘（constipation）是一种由肠道症状定义的综合征，表现为排便次数减少和（或）排便困难、粪便干硬、排便不尽感[1]。据流行病学调查显示，我国成人慢性便秘的患病率为4%～6%[2-4]，且患病率随年龄增长而升高，60岁以上人群慢性便秘患病率高达22%[5]。便秘不但给患者带来直接的痛苦，而且还可能诱发心脑血管疾病，增加大肠癌患病率[6-7]，导致抑郁或焦虑等，严重影响患者的生活质量[8]，并给社会经济造成巨大负担[9]。

目前便秘常用的防治方法是药物治疗和饮食调节[10-15]。药物治疗常使用渗透性泻剂[16-17]、刺激性泻剂[18-19]、促分泌剂[20]和促动力剂[21]等，效果多数虽较明显，但有一定副作用。饮食调节近年来成为研究热点，有较多关于补充低聚糖[11-12]、膳食纤维[13-14]和益生菌[15]对通便作用的研究报道，但不同种类的低聚糖、膳食纤维通便的作用均有差异。壳寡糖（chitooligosaccharide，COS）是 2-氨基-2 脱氧-β-D-葡萄糖通过 β-1，4糖苷键连接的呈碱性的水溶性低聚糖[22]，分子量范围在322 Da～1 610 Da。2014年，卫计委第六号公告正式批准壳寡糖为新食品原料。关于COS通便作用鲜见研究报道。因此，以昆明小鼠为对象，开展本研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

壳寡糖：山东卫康生物医药科技有限公司，含量84%，相对分子质量为322 Da～1 610 Da；盐酸洛哌丁胺：西安杨森制药有限公司；阿拉伯树胶：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；活性炭粉：分析纯，天津市福晨化学试剂；101-1型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器仪表有限公司；JJ1000型电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；BS-110S天平：北京赛多利斯天平有限公司。

1.2 动物

昆明种小白鼠SPF级（雄性，初始体重为18 g～22 g），由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（粤）2013-0002，小鼠饲养于华南农业大学实验动物中心，室温（25±2）℃，相对湿度（55±5）%，自由获取食物和饮水，实验动物使用许可证号SYXK（粤）2014-0136，屏障环境由华南农业大学实验动物中心提供。

1.3 实验方法

根据《保健食品检验与评价技术规范（2003版）》中“通便功能检验方法”[23]设计小肠运动实验和排便实验，并在此基础上测定粪便含水量。

1.3.1 剂量设计与分组

在小肠运动实验中，50只小鼠经适应性喂养1周

1.3.4 排便时间、粪便粒数和粪便重量测定

受试物灌胃方式同1.3.3。7 d后各组小鼠禁食不禁水16 h，模型对照组和3个剂量组分别给予盐酸洛哌丁胺（10 mg/kg·BW），空白对照组给予蒸馏水，30 min后，COS 3个剂量组分别给予含相应COS浓度的墨汁（含5%活性炭粉、10%阿拉伯树胶），空白对照组和模型对照给墨汁灌胃后，每只小鼠均单笼饲养，正常饮食进水。从给予墨汁开始计时，观察记录每只小鼠排出首粒黑便时间、6 h内黑便粒数及重量。

1.3.5 粪便含水量的测定

收集1.3.4方法中6 h内的新鲜粪便，立即称量，随后105℃烘干至恒重，称量其干重。计算粪便含水量[24]。计算如式（2）：后，按体重随机分组，每组10只。依据壳寡糖的人体推荐最大摄入量（0.5 g/d，人体体重以60 kg计），分别以人体最大推荐剂量的10、20、40倍设置小鼠的低、中、高剂量组，即剂量分别为99.2、198.4、396.8 mg/（kg·d）。空白对照组和模型对照组均给予蒸馏水。排便实验小鼠只数与分组方式同前。

1.3.2 试剂的配置

墨汁的配置：准确称取阿拉伯树胶100 g，加水800 mL，煮沸至溶液透明，称取活性碳粉50 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液凉后加水定容到1 000 mL，于冰箱中4℃保存，用前摇匀。

盐酸洛哌丁胺悬浊液的配置：临用前，根据小鼠体重和灌胃剂量（0.3 mL），配置盐酸洛哌丁胺悬浊液。在小肠运动实验中，盐酸洛哌丁胺给予剂量为5 mg/kg·BW，在排便实验中，盐酸洛哌丁胺给予剂量为 10 mg/kg·BW。

1.3.3 小肠运动实验

每日定时经口灌胃一次，灌胃体积为0.3 mL。剂量组给予不同浓度的COS，空白对照组和模型对照组均给予等体积蒸馏水，连续灌胃7 d。7 d后各组小鼠禁食不禁水16 h，模型对照组和COS 3个剂量组给予盐酸洛哌丁胺（5 mg/kg·BW），空白对照组给予蒸馏水。30 min后，COS 3个剂量组分别给予含相应COS浓度的墨汁（含5%活性炭粉、10%阿拉伯树胶），空白对照组和模型对照组给予墨汁灌胃。25 min后颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至盲肠部的整段小肠，不加牵引平铺呈直线。测量小肠全长和幽门至墨汁运动前沿，计算小肠墨汁推进率，如式（1）。

1.4 数据处理及结果判定

采用SPSS Statistics 20.0软件对数据进行统计分析。小肠墨汁推进率需进行数据转换，转换公式如式（3）。需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，若方差齐时，采用最小显著性差异法（least significant difference，LSD）检验；若方差不齐，则进行适当的变量转换，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐的目的，改用秩和检验进行统计分析[23]。

式中：p为小肠墨汁推进率，转换值X用小数表示。

6 h内黑便粒数或6 h内黑便重量任一项结果阳性，同时小肠运动实验和首粒排黑便时间任一项结果阳性，可判定该项实验结果阳性[23]。

2 结果与分析

2.1 壳寡糖对小鼠体重的影响

进行小肠运动实验和排便实验时各组小鼠初始体重一致（见表1、表2）。给予相应受试物7 d后，空白对照组、模型对照组及3个剂量组小鼠最终体重均无显著性差异，表明COS对小鼠的正常生长发育无不良影响。

表1 小肠墨汁推进实验中壳寡糖对小鼠体重的影响Table 1 The effect of COS on the weight of mice in intestinal movement experiment

表2 排便实验中COS对小鼠体重的影响Table 2 The effect of COS on the weight of mice in defecating experiment

2.2 壳寡糖对小鼠小肠运动的影响

壳寡糖对小鼠小肠运动的影响见表3。

表3 COS对小鼠小肠运动的影响Table 3 The effect of COS on intestinal movement of mice

在小肠运动实验中，模型对照组与空白对照组比，小肠墨汁推进率显著降低（p<0.01），表明给予盐酸洛哌丁胺后，小鼠小肠蠕动抑制模型建立成功。与模型对照组比，各剂量组小肠墨汁推进率均有一定程度增加，其中，COS中剂量组小肠墨汁推进率（51.96±9.95）%显著增加（p<0.05），COS高剂量组小肠墨汁推进率（60.48±13.60）%极显著增加（p<0.01）。

表4 COS对小鼠排便的影响Table 4 The effect of COS on defecating of mice

2.3 壳寡糖对小鼠排便时间、粪便粒数和粪便重量的影响

壳寡糖对小鼠排便时间、粪便粒数和粪便重量的影响见表4。

在排便试验中，模型对照组小鼠首粒排黑便时间极显著长于空白对照组（p<0.01），而6 h黑便粒数和重量均极显著小于空白对照组（p<0.01），说明小鼠便秘模型成立。在首粒排黑便时间上，与模型对照组（342.4±33.6）min比，COS各剂量组小鼠的首粒排黑便时间均有一定程度的缩短，并呈剂量依赖关系，其中高剂量组（157.2±56.4）min首粒排黑便时间极显著缩短（p＜0.01）；在小鼠6 h黑便粒数和黑便重量上，随着COS剂量增加而增加，其中COS高剂量组6 h黑便粒数（7.8±3.7）粒相对模型对照组（1.9±2.0）粒显著增加（p＜0.05）。在小鼠6 h黑便重量上，中剂量组小鼠（134±63）mg和高剂量组小鼠（145±80）mg相对模型对照组小鼠（33±43）mg均显著增加（p＜0.05）。

表5 COS对小鼠粪便含水量的影响Table 5 Effect of COS on stool moisture content

表6 COS和其他低聚糖对小鼠通便的作用Table 6 The laxative effect of COS and the other oligosaccharides on mice

2.4 壳寡糖对小鼠粪便含水量的影响

壳寡糖对小鼠粪便含水量的影响见表5。

由表5可知，模型对照组和空白对照组与COS各剂量组小鼠的粪便含水量间无显著差异，表明COS各剂量组并未增加小鼠粪便持水。

2.5 COS和其他低聚糖对小鼠通便的作用

COS和其他低聚糖对小鼠通便的作用见表6。

本实验结果与其他低聚糖通便功能研究结果[25-28]相比，其有效剂量相对较低，表明COS具有通便潜在的优势（表6）。如小肠墨汁推进率指标，本实验COS中剂量组[198.4 mg/（kg·d）]呈现显效（p<0.05），而低聚果糖[25]、低聚果糖[26]、皇帝蕉低聚糖[28]、粉蕉低聚糖[28]分别为9.90、2.50、1.25、1.25 g/（kg·d）时才达到显效（p<0.05或p<0.01），有效剂量约相差6倍到49倍；首粒黑便时间（min）、6 h黑便粒数、6 h黑便重量（mg）等指标也呈现类似趋势。

3 讨论

结果表明：与模型对照组比，COS中剂量组[198.4 mg/（kg·d）]显著增加小鼠小肠墨汁推进率和6 h黑便重量（p<0.05）；COS高剂量组[396.8 mg/（kg·d）]极显著增加小鼠小肠墨汁推进率（p<0.01）、极显著缩短首粒排黑便时间（p<0.01）、显著增加6 h黑便重量和6 h黑便粒数（p<0.05）。根据卫生部“通便功能检验方法”[23]判定标准，当小肠运动实验和排便时间任一项结果阳性，同时6 h黑便粒数和6 h黑便重量任一结果阳性，可判定COS对小鼠有通便作用。在COS中剂量下，小肠墨汁推进率和6 h黑便质量均显著增加（p<0.05），可判定COS对小鼠有通便作用，COS高剂量组4项结果均为阳性，通便作用更佳。

关于低聚糖通便可能有两条途径，一是通过增加粪便含水量，软化粪便、增大体积，从而改善便秘[29-32]；二是调节肠道菌群，促进微生物发酵，从而加速肠道传输[32-36]；或者二者兼有。本实验中，各剂量组、模型对照组及空白对照组之间，粪便含水量无显著性差异，表明COS不是通过第一条途径起作用的，推测可能是通过第二条途径起作用，即COS调节肠道菌群，促进微生物发酵，酵解产物（特别是短链脂肪酸）产生渗透作用，从而加速肠道传输，通便。