北京棒杆菌E31天冬氨酸激酶突变体T361D酶学性质表征

陈晨，闵伟红，张芷睿，方丽

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

天冬氨酸代谢途径能够催化生成苏氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸，这3种氨基酸为人类及动物体内的必需氨基酸，不能依靠自身合成，只能从食物中获取[1-2]。目前，这几种氨基酸在医药、食品，保健等方面都有广泛的应用，主要依靠化学合成法和微生物发酵法进行氨基酸生产，其中，化学合成法的工艺复杂，合成过程中含有毒害物质，且产物多为D、L-型混旋体，而微生物发酵法大多为微生物在合适营养环境下自发，氨基酸产物无污染。但微生物在发酵过程中，具有严密的调节机制，若大量生产氨基酸，需打破部分代谢调控机制[3]。

在天冬氨酸族氨基酸的代谢途径中，天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）作为第一关键酶[4]对整体途径具有非常重要的调控作用[5]，其催化天冬氨酸产生苏氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸但同时又受赖氨酸和苏氨酸两种代谢产物的协同反馈抑制[6]，因此限制了天冬氨酸族氨基酸的产量。如何打破二者对其的反馈抑制作用，从而使末端氨基酸大量积累，具有重要的研究意义[7-9]。

通过天冬氨酸激酶的基因序列比对，证明北京棒杆菌天冬氨酸激酶（AKfromCorynebacteriumpekinense，CpAK）与谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶（AK from Corynebacterium glutamicum，CgAK） 的同源性高达99.58%，且反馈抑制机制相似[10]。并且确定北京棒杆菌T361为保守位点。因此本研究以蛋白质数据库（protein data bank，PDB）中CgAK晶体结构（代码：3aaw）[11]为模板对CpAK T361位点进行饱和定点突变，采用高通量筛选技术选择酶活力提高明显的T361D突变株，研究T361D AK的酶动力学及酶学性质，为减弱或解除抑制剂对酶活力的反馈抑制作用与构建天冬氨酸族氨基酸基因工程菌提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

北京棒杆菌C.pekinense E31：吉林农业大学发酵工程实验室保存，其AK基因连接在pET-28a质粒上。

1.1.2 培养基

溶菌肉汤（Luria-Bertani，LB）培养基[12]（含50μg/mL卡那霉素）：Genview公司。

1.1.3 试剂

PCR试剂盒、质粒抽提试剂盒、电泳Marker、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶试剂盒：大连TaKaRa公司；卡那霉素、异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）：Genview公司。

1.1.4 主要仪器

酶标仪（infinitieM200）：TECAN 公司；蛋白电泳仪（SE260）：GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司；超声波破碎仪（Scientz-ⅡD）：宁波新芝生物科技有限公司；高速冷冻离心机（Z36HK）：德国HERMLE公司；PCR仪（AG）：eppendorf中国有限公司。

1.2 饱和突变引物设计

运用软件Primer Premier 5对T361位点进行引物设计后送至上海生工生物公司进行合成，引物设计如下（引物中划线部分NNN为突变位点）：

1.3 重组质粒pET-28a-AK提取及定点突变

参照质粒提取试剂盒中说明进行重组质粒pET-28a-AK的提取，以重组质粒为模板进行突变PCR后用于0.1%琼脂糖凝胶核酸电泳验证[13]，并将验证成功后的产物进行消化。

1.4 消化产物转化

将1.2 μL消化后的产物导入 BL21（DE3）感受态细胞中，冰浴后加入900 μL不含卡那霉素的LB培养基，在37℃、160 r/min条件下培养约 1 h，8 000 r/min离心1 min后保留200 μL上清液，重悬后涂布于LB固体培养基上[14]。

1.5 菌液PCR验证及突变株高通量筛选

将转化成功的菌落保存在含有200 μL LB液体培养基的96孔板中，活化两次后加入诱导剂IPTG（终浓度为1 mmol/L），30℃、130 r/min诱导8 h。诱导后3 500 r/min离心45 min，弃上清，收集菌体。加入100 μLPBS重悬，在-80℃、30 min和30℃、30 min条件下交替冻融3次～5次，将活力提高明显的突变株在37℃、180 r/min条件下过夜培养。在克隆引物的作用下，以扩大培养后的菌液为模板进行PCR扩增[13]，进行0.1%琼脂糖凝胶核酸电泳验证，证明CpAK基因导入到菌体中，同时取1 mL菌液送至上海生工测序进行高通量筛选，进一步确定此菌体是否突变成功，并将筛选成功的突变株菌种保存用于后续试验。

1.6 AK粗酶液及纯化液制备

取2 mL活化后菌液转接至100 mL LB培养基，37℃、200 r/min培养至OD600达0.6～0.8，加IPTG诱导发酵8 h。4℃、8 000 r/min离心10 min后弃上清液，加10 mL～15 mL预冷的PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎 14 min，4℃、8 000 rpm 离心 10 min，过 0.22 μm 滤膜即得AK粗酶液[14]。分别用20 mmol/L咪唑20 mL、40 mmol/L咪唑 15 mL、70 mmol/L咪唑 10 mL、100 mmol/L咪唑5 mL、200 mmol/L 3 mL咪唑进行洗涤以除去杂蛋白，再用500 mmol/L咪唑5 mL进行洗脱，同时用15 mLEP管进行接样，所得即为AK纯化液[15]。

1.7 SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）验证

将AK的粗酶液及纯化液进行SDS-PAGE与Western blot验证[16]。

1.8 酶动力学研究

本文研究采用5mL反应体系：底物L-天冬氨酸10 mmol/L、氨水 800 mmol/L、Tris-HCl缓冲液（pH8.0）100 mmol/L、β-巯基乙醇 10 mmol/L、ATP10.4 mmol/L、硫酸镁1.6 mmol/L和氯化钾800 mmol/L。对于酶动力学研究，需改变底物L-天冬氨酸浓度（分别为0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L），反应体系中其它条件不变，测定AK的活力。以Hill方程V=Vmax（Sn）/（Kn+Sn）进行线性拟合。

1.9 酶学性质研究

酶学性质的研究与酶动力学研究反应体系相同，均为5 mL反应体系。

1.9.1 最适pH值研究

反应体系其他条件不变，改变Tris-HCL的pH值（从6.0～10.0），测定AK的最适pH值。每个PH值检测3个平行，将酶活最高组所对应的pH值定义为100%。

1.9.2 最适温度研究

反应体系不变，在不同温度下（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50℃）测定 AK 的最适温度[14]。每个温度检测3个平行，将酶活最高组所对应的温度定义为100%。

1.9.3 稳定性研究

反应体系其他条件不变，在最适的pH值和温度下测定AK的酶活（间隔1 h）。每1个小时检测3个平行，对照组反应体系中不含有L-天冬氨酸，在0 h测量所得的相对酶活数值定义为100%。

1.9.4 底物抑制剂对AK活力的影响

在反应体系中添加不同浓度（0.2、1、5、10 mmol/L）的底物抑制剂，分别是：苏氨酸（Threonine，Thr）、甲硫氨酸（Methionine，Met）、Lys、Thr+Met、Thr+Lys，Lys+Met和Thr+Lys+Met，测定抑制剂对AK活力的影响[14]。每组底物抑制剂检测3个平行，共28组试验，对照组的反应体系中不含有底物抑制剂，对照组相对酶活数值定义为100%。

1.9.5 金属离子对AK活力的影响

在反应体系中添加不同浓度（0.2、1、5、10 mmol/L）的金属离子，分别是：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+，测定金属离子对 AK 活力的影响[14]。每组金属离子检测3个平行，共36组试验，对照组的反应体系中不含有金属离子，对照组相对酶活力数值定义为100%。

1.9.6 有机溶剂对AK活力的影响

在反应体系中添加不同浓度的（0.2、1、5、10mmol/L）有机溶剂，分别是：甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、二甲基亚砜、甘油，测定有机溶剂对AK活力的影响[14]。每组有机溶剂检测3个平行，共28组试验，对照组的反应体系中不含有有机溶剂，对照组相对酶活力数值定义为100%。

1.10 数据分析

进行3组平行试验并用平均数加减标准差（mean±SD，x±s）表示。采用 SPSS19.0及 Origin8.5进行分析。

2 结果与分析

2.1 突变体T361D重组菌的构建

突变PCR及菌液PCR扩增结果见图1。

图1 PCR产物的1%琼脂糖核酸电泳验证Fig.1 1%agarose nucleic acid electrophoresis verification of PCR products

突变PCR结果如图1A，分别在54、56、58℃3个退火温度下进行PCR扩增。约7 000 bp处出现目标条带，这与pET-28a-AK质粒长度6 822 bp（pET-28a 5 369 bp，CpAK 1 453 bp）相一致，结果表明了在退火温度下，质粒复制成功，引物在重组质粒的作用下实现了大量扩增。

菌液PCR结果如图1B，约1 000 bp～2 000 bp之间存在目标条带，且与AK长度1 453 bp相对应，证明AK基因已导入BL21感受态细胞。测序（由上海生工进行）结果表示361位点氨基酸由T变为D，进一步验证已成功构建突变体T361D。

2.2 SDS-PAGE和Western blot验证

SDS-PAGE和Western blot验证结果见图2。

图2 12%SDS-PAGE和Western blot验证结果Fig.2 Results of 12%SDS-PAGE and Western blot

如图2A所示，经纯化后突变体在48KDa位置处出现条带；Western blot验证结果如图2B所示，野生型和突变体T361D在48KDa位置处出现条带，证明突变后AK表达成功。

2.3 T361D动力学结果

野生型（wild type，WT）和T361D动力学结果见图3。

图3 WT和T361D动力学结果Fig.3 Dynamics result of WT and T361D

如图3所示，T361D AK的最大反应速率Vmax为25.34 U/mg·min，较 WT（Vmax 为 3.32 U/mg·min）提高了7.63倍；T361D AK的动力学参数Km值为4.60，与WT Km为4.13相比有所提高，说明T361D AK与底物的亲和力下降；WT的希尔系数n值为4.57，T361D AK n值为1.26，突变后n值明显低于野生型，证明正协同效应降低，突变后更趋于米氏酶，结合位点由致密结构变成松散结构，因此不利于与抑制剂相结合。

2.4 T361D酶学性质表征

2.4.1 最适温度和最适pH值

最适温度和最适pH值研究结果见图4。

图4 WT和T361D最适温度（A）与PH值（B）Fig.4 The effect of optimum temperature(A)、pH(B)to WT and T361D

如图4A所示，与WT相比T361D的最适温度由26℃升高至30℃，在15℃～30℃区间内，酶活力逐渐升高并达到峰值，在30℃～50℃区间内，酶活力逐渐降低；如图4B所示，与WT相比T361D最适pH值从7.5降低到7.0，当pH值小于7时，酶活力逐渐增高并达到峰值，而在大于7时，酶活力逐渐降低，当pH值达到10时，酶活力已不足10%。

这表明当温度或pH值较低时，大部分酶的活性也较低，可以用于酶的保存；当温度或pH值在最适区间时，酶的活性可逐渐达到最大，并对酶的催化反应有利；当温度或pH值过高时，会使酶发生变性，逐渐失去活力。

2.4.2 稳定性

稳定性研究结果见图5。

图5 WT和T361D的热稳定性Fig.5 The stability curves of WT and T361D

表1 金属离子对WT与T361D酶活力的影响Table 1 The influence of metalions on the enzyme activity WT and T361D

如图5所示，在最适的温度（30℃）和pH（7.0）的情况下，测定WT和T361D酶活力和时间的关系[17-18]。野生型和突变体T361D的半衰期分别为3.9 h和4.9 h，突变后半衰期延长1 h，说明突变后AK的稳定性增强。

2.4.3 金属离子对AK活力的影响

金属离子对AK活力的影响见表1。

由表1可知，对于WT的影响，Mg2+和Mn2+对野生型有不同程度的激活作用，而 Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+和Ni2+对野生型均表现出不同程度的抑制作用；对T361D AK的影响，一价金属离子Na+和K+对酶产生明显的激活作用；二价金属离子，只有0.2 mmol/L的Mn2+表现出激活作用，其它金属离子均有不同程度的抑制作用；三价金属离子Fe3+产生抑制作用。

2.4.4 有机溶剂对AK活力的影响

有机溶剂对AK活力的影响见表2。

表2 有机溶剂对WT与T361D酶活力的影响Table 2 The influence of organic solvent on the enzyme activity WT and T361D

由表2可知，对于WT的影响，0.2 mmol/L与1 mmol/L的乙醇对野生型AK表现出激活作用，其他有机溶剂均有着不同程度的抑制作用；对T361D AK的影响，甲醇、异丙醇对AK的酶活力均有明显提高，尤以浓度为10 mmol/L的甲醇和5 mmol/L、10 mmol/L的异丙醇对AK激活作用显著，其他有机溶剂如正丁醇、乙腈对AK基本无激活，而乙醇、二甲基亚砜和甘油对AK酶活力均起到不同程度的抑制作用。

2.4.5 底物抑制剂对AK活力的影响

底物抑制剂对AK活力的影响见表3。

表3 底物抑制剂对WT与T361D酶活力的影响Table 3 The influence of substrate inhibitors on the enzyme activity of WT and T361D

由表3可知，对于 WT 的影响，在 Thr、Lys、Thr+Lys、Thr+Lys+Met存在条件下对野生型存在较强的抑制作用，在 Met、Thr+Met、Lys+Met存在条件下对野生型仍存在一定的抑制作用，但这些含有Met的组合均不同程度减弱了抑制作用；对T361D AK的影响，Met、Thr+Met存在条件下对T361D仍起到抑制作用，Thr+Lys+Met存在条件下仍存在抑制作用，但较野生型有明显提高，Thr和Lys单独存在时酶活力提高明显，且表现出激活作用，Thr+Lys和Lys+Met的条件下活力提高明显，且在高浓度条件下表现出激活作用。因此，说明在Lys或含有Lys的组合存在下对T361D的抑制作用部分解除，对AK酶活力产生激活作用，正与本研究的目的相符。

2.5 野生型及突变体T361D的空间结构比较

CgAK晶体结构见图6。

图6 CgAK晶体结构（PDB：3aaw）Fig.6 CgAK crystal structure（PDB：3aaw）

如图6所示，CgAK晶体结构（3aaw，PDB）[11]中的 4个区域代表4个亚基，中间部分表示α亚基，两侧表示β亚基，α亚基和β亚基上都存在赖氨酸和苏氨酸抑制剂结合位点[19]，当有赖氨酸或苏氨酸结合时，导致AK的空间结构发生变化，不利于底物与AK结合，会使AK活力降低，对酶起抑制作用。T361D空间结构比较见图7。

图7 T361D空间结构比较Fig.7 T361D spatial structure comparison

由图7可知，突变后氨基酸侧链官能团发生了改变，使氨基酸所带电荷和空间结构发生变化，由极性不带电转变为带负电，且突变后AK与抑制剂Lys间发生离子键断裂，R基远离抑制剂Lys，因此抑制剂Lys稳定性降低，解除了抑制剂对AK酶活力的影响。

3 结论

对北京棒杆菌天冬氨酸激酶T361位点进行突变，从而解除与抑制剂Lys的离子键作用且将酶活提高。T361D与WT相比，酶动力学Vmax提高了7.63倍；最佳pH值降低至7.0，最佳反应温度提升至30℃；半衰期由野生型的3.9 h延长到4.9 h；同时，突变体T361D对金属离子Na+、K+和有机溶剂甲醇、异丙醇均表现出良好的抗性；底物抑制剂Lys以及含有Lys的组合对突变体T361D的抑制作用部分解除并表现出激活作用。综上所述，本研究为解除AK的反馈抑制作用，从而获得高产的天冬氨酸族氨基酸菌株提供了一定的理论依据。