豆豉中产甲基萘醌菌株分离、筛选及其鉴定

杜霞，陈卫平，袁干军，邝丙娣

（1.江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045；2.江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌330045）

甲基萘醌（menaquinone，MK），又称为维生素 K2，由甲基萘醌母环和3号位上异戊二烯侧链组成，为一类2-甲基-1，4-萘醌同系物的总称[1]。根据其侧链异戊二烯结构数目不同，可分为14种，用MK-n表示（如图1）。MK最早由丹麦化学家Henfik Dam在研究胆固醇代谢时发现[2]，结构不稳定，对光和碱敏感，易被氧化，不溶于水，易溶于有机溶剂[3]。MK作为人体所必须的脂溶性营养素之一，具有重要生理活性。MK为将谷氨酸残基转化为γ羟基谷氨酸的羟化酶合成的重要辅助因子，与Ca+鳌合以促进血液凝固[4]。同时有效预防骨质疏松功效[5-6]。MK能降低外界对大脑新型胶质细胞的损伤，可用于治疗心血管疾病[7]，癌症[8]，帕金森[9]等疾病。目前MK生产方式主要为化学合成，此方法具有成本高，产物产量低，反应条件严格等劣势，相对而言，微生物生产以产量高，成本低，反应温和，副产物少等优点吸引众多研究者的目光[10]。

自然界中许多芽孢杆菌呼吸过程能产生甲基萘醌[11]，如解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）[12]，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）[13-14]，黄杆菌（Flavobacterium sp.）[15]，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[16]，迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus）[17]，苏云金腊样芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）[18]等，其中尤其是纳豆芽孢杆菌MK产量较高，得到国内外的广泛注意和研究[19]。豆类食品中富含维生素K2，并且适宜各种芽孢杆菌生长。据此学者们从各种豆类食品中筛选出产MK菌株，如日本纳豆[17-18]，云南香草豆[20]，韩国清曲豆酱[21]等。在我国，豆豉是一种以豆类为原料发酵生产的传统食品，风味独特，营养价值高[22]。本研究以江西特产发酵型豆豉为原材料，利用耐热性分离芽孢杆菌。菌株发酵液经离心，冷冻干燥，萃取纯化处理后，进行高效液相色谱（high performance liquid chromatograph，HPLC）检测，筛选得到目标菌株并鉴定。为MK微生物生产提供一株优良菌株。试验结果表明，此筛选方案切实可行，为产MK菌株筛选提供了可行性方法。

图1 MK-n化学结构式Fig.1 The structural formula of MK-n

1 材料与方法

1.1 材料

样品来源：江西产发酵型豆豉。

1.2 培养基

初筛培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl0.5g，琼脂1.5 g，水100 mL，pH 7.4。种子培养基：葡萄糖1.5 g，蛋白胨 1.5 g，KH2PO40.1 g，K2HPO4·3H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，水 100 mL，pH7.0～7.2。发酵培养基：甘油0.5 g，豆粉 4 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，KH2PO40.1 g，NaCl 0.3 g，水 100 mL，pH7.0～7.2。

1.3 试剂

MK-7标准品（≥99.8%）：美国ChromaDex公司；异丙醇、甲醇（色谱纯）：美国TEDIA公司；氯仿、四氢呋喃、戊二醛、乙醇（分析纯）：上海国药试剂公司。

1.4 仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅（MLS-3751L）：日本松下健康医疗器械株式会社；高效液相色谱仪（Waters e2695）、检测器（2998ePDA）、C18色谱柱高效色谱柱（460 mm×250 mm，5 μm）：美国 Waters公司；DNA 抽提试剂盒：生物工程（上海）股份有限公司；PCR仪：美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机（GL-21M）：湘仪离心机仪器有限公司；超声波细胞粉碎机（XINYI-IID）：宁波新艺超声设备有限公司；真空冷冻干燥机（FD-10-50）：北京博医康实验仪器有限公司；场发射扫描电镜（JSM-6701F）：日本电子株式会社；飞行时间高分辨质谱（AB Sciex 5600）：美国安捷伦科技公司。

1.5 试验方法

1.5.1 芽孢杆菌筛选

无菌条件下称取5 g豆豉，于50 mL无菌生理盐水，80℃水浴30 min。震荡混匀，取1 mL菌液于9 mL生理盐水，稀释至适宜浓度。采用涂布平板法，分离出单菌落。对单菌落进行革兰氏染色和光学显微镜观察菌落特征，选择革兰氏染色阳性杆状菌株，即芽孢杆菌，保存以备下一步试验。

1.5.2 摇瓶发酵复筛

取初筛菌株，接两环于250 mL三角瓶中，装瓶量为100 mL种子培养基进行菌种活化，条件为：37℃，110 r/min，培养24 h。按照3%（体积分数）接种量接种于装有100 mL液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，在37℃，110 r/min条件下培养3 d。

1.5.3 发酵产物分析

发酵液处理：发酵液在4℃，6 000 r/min高速离心15 min，重复3遍，收集下层沉淀菌体。置于-80℃冰箱8 h，真空冷冻干燥1.5 d，得到干燥菌体。按照有机溶液∶菌体体积比为35∶1加入，有机溶剂为甲醇与异丙醇等量混合，细胞破碎处理（超声2 s，间隙3 s）12 min，减压抽滤，收集萃取液。在25℃条件旋转蒸发，得到浓缩样品。

产物分析：将浓缩样品溶解于上机液（异丙醇∶四氢呋喃体积比为9∶1）中，准确定容至2 mL，过0.22 μm微孔滤膜。HPLC检测分析。对发酵液进行初步分析，与标准品保留时间比较，确定是否含有MK-7。利用峰面积定量分析，筛选得到产量较高菌株。

HPLC色谱条件：流动相甲醇∶异丁醇体积比为4∶1，流速1 mL/min，柱温40℃。检测器PDA（光电二极管矩阵检测器，检测波长245 nm），进样量为20 μL。

1.5.4 产物液相色谱-质谱联用（liquid chromatographmass spectrometer，LC-MS）验证

发酵液提取样品经HPLC分离，质谱扫描检测，验证菌株次级代谢产物中MK产物结构。

产物制备：通过高效液相色谱柱分离，根据产物出峰时间在高效液相色谱仪检测器后的出口收集样品约500 mL。旋转蒸发浓缩，再溶解于异丙醇中，定容至2 mL，以备LC-MS检测。

LC-MS质谱条件：加速电压15 kV，加速速率30 kHz，ESI电喷雾离子源，负离子模式扫描，离子源温度550℃，检测器为TDC40 GHz。

1.5.5 菌株鉴定

形态学观察：将所筛选菌株活化后稀释涂布至平板上观察菌落形态，接种环挑取菌株纯培养物革兰氏染色，在光学显微镜下观察。

电镜扫描（scanning electron microscope，SEM）观察：取适量种子液涂至无菌载玻片上，用生理盐水冲洗2遍，2.5%戊二醛浸泡固定8 h。梯度乙醇洗脱（浓度依次为10%，30%，50%，70%，90%），最后用100%乙醇冲洗2遍[23]，空气中晾干，喷金，电镜观察。

生理生化鉴定：参照《伯杰氏手册》[24]对目标菌株进行生理生化试验。

分子生物学鉴定：利用DNA抽提试剂盒提取基因组，使用细菌通用引物进行PCR扩增。PCR循环条件为94℃预变性4 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1min，进行30个循环，72℃修复延伸10 min，4℃终止反应。取PCR产物上样1%琼脂糖凝胶，150V、100 mA、20 min电泳观察。再将扩增产物送至生物工程（上海）股份有限公司测序。

同源性分析：将序列上传NCBI数据库，进行blast同源序列检测，获得同源性较高菌株16S rDNA序列。应用BioEdit软件分析各16S rDNA序列之间的同源性，并通过Clustalx 1.83及MEGA 6.0软件，根据相似相邻法则（Neighbor-Joining）构建同源性系统发育树。将序列提交至NCBI网站，获得登录ID号。

1.5.6 菌株发酵进程监测

菌株活化后接种至发酵培养基，在37℃，110 r/min条件下，发酵6 d。每隔24小时测定菌体干重和MK-7产量，绘制发酵进程监测曲线。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选结果

豆豉菌液经过80℃水浴30 min后，利用芽孢杆菌的耐热性进行筛选。对平板涂布法挑选出的单菌落进行革兰氏染色和形态学观察，挑选染色结果为革兰氏阳性，显微结构为杆状菌株保存，分离得到29株所需菌株。将初筛芽孢杆菌按照上述条件进行摇瓶发酵，发酵液经HPLC检测，在245 nm波长下，出峰时间为22.5 min左右，色谱图如图2所示。

图2 菌株产物HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of the strain production

与标准品MK-7保留时间相同菌株共有16株，菌株筛选结果见表1。

由表1可知，DC-1菌株MK产量较高，在同等条件下发酵培养3 d，MK-7产量可达0.317 mg/L。因此选择菌株DC-1为目标菌株，以该菌株为后续研究的出发菌株。

2.2 菌株DC-1发酵产物LC-MS分析结果

菌株发酵产物LC-MS图谱总离子流图与质谱图见图3。

表1 产MK-7菌株筛选结果Table 1 Screening results of the MK-7 producers

图3 菌株发酵产物LC-MS图谱Fig.3 Results of fermentation product by LC-MS

由总离子流图3（a），质量色谱图3（b）可知，相对丰度最高的物质质荷比（m/z）为648.506 1，其产物与MK-7分子量648.496 0相吻合，因此可以推断出DC-1菌株在液相色谱22.5 min处洗脱峰对应的产物为本研究目的产物MK。

2.3 菌种鉴定

2.3.1 菌株DC-1形态观察结果

宏观形态观察：菌株纯培养物观察如图4。

由图4可知，菌落淡黄色，表面无光泽，有褶皱，中间草帽状突起，边缘不规则，质地松软黏稠，有臭鸡蛋气味。

微观形态观察：菌株DC-1微观形态图如图5。

图4 菌株DC-1宏观菌落形态图Fig.4 Macroscopic colony characteristics of the strain DC-1

图5 菌株DC-1微观形态图Fig.5 Microscopic colony characteristics of the strain DC-1

由图5结果可知，显微镜观察革兰氏染色结果为阳性，杆状呈链状排布。扫描电子显微镜（SEM）利用电子束扫描样品得到高分辨率的三维结构图，由图可以看出DC-1菌株为长条杆状，长度约为1 μm～2.5 μm。

2.3.2 菌株生理生化试验结果

菌株DC-1生理生化试验结果见表2。

表2 DC-1生理生化试验结果Table 2 Biological characteristics of the strain DC-1

2.3.3 菌株分子生物学鉴定结果

PCR产物测得基因序列数目为1 421 bp。基因序列在基因数据库（GenaBank）中blast比对分析，发现与菌株Bacillus subtilis HMJ-2和Bacillus subtilis IARI-NIAW1-13同源性高达99%以上。结合该菌的形态学和生理生化特征，鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis DC-1。将该菌的16s rDNA序列提交至GenaBank数据库，得到序列ID为MG266437。在NCBI数据库中下载相似度高菌株序列，利用MEGE6.0软件，构建同源性系统发育树，如图6所示。

图6 DC-1菌株同源性分析树Fig.6 Homology phylogenetic tree of the strain DC-1

2.3.4 菌株发酵进程监测曲线

在37℃，摇床转速为110 r/min条件，Bacillus subtilis DC-1发酵培养6 d，每隔1天测定发酵液中MK-7含量和菌体干重，绘制发酵进程监测曲线如图7。

图7 Bacillus subtilis DC-1发酵进程监测曲线Fig.7 Fermentation curve of Bacillus subtilis DC-1

由图7可知发酵前4天，随时间增长，菌体生物量增加，发酵液中MK-7含量呈较快速度增长。而发酵第4天后，菌体生物量增加缓慢，发酵液中MK-7含量下降，试验结果与李拖平等的研究结果一致[25]，可能由于MK结构不稳定，在发酵液中分解，导致发酵液中MK-7产量降低。由试验结果可知，菌体发酵过程第4天，MK-7产量最高，为0.416 mg/L。

3 结论

本研究通过平板初筛和摇瓶筛选相结合的方法从发酵豆豉中筛选出1株产MK菌株DC-1。经过形态学观察，生理生化，分子生物学试验与分析，鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。利用HPLC和LC-MS对菌株发酵液分析，确定菌株产物为MK-7。Bacillus subtilis DC-1在37℃，110 r/min条件下发酵4 d，MK-7产量为0.416 mg/L。该菌株具有较强研究意义和广阔应用前景，可为后续菌种诱变选育，发酵培养条件优化提供原材料，并为从微生物发酵方向获得MK提供重要依据。