鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

顾玲玲，朱善元，王安平

(江苏农牧科技职业学院 江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300)

自2010年4月以来，我国大部分养鸭地区包括浙江、广东、广西、江苏、河北、福建、山东等爆发了一种以蛋鸭产蛋严重下降为特征的急性传染病。该病的传播相当迅速，给我国养鸭业带来了巨大威胁。经分离鉴定，该病由一种新病毒引起，该病毒属于黄病毒科黄病毒属，命名为鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus，DTMUV)[1-4]。

鸭坦布苏病毒粒子的大小为45～50 nm，基因组为单股正链RNA，全长约11 kb，只编码1个多聚蛋白，即仅含有一个开放阅读框(ORF)。此多聚蛋白经蛋白酶剪切形成3种结构蛋白(C、PrM、E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[5-6]。其中，E基因编码的囊膜蛋白E是病毒最大的结构蛋白和主要的包膜蛋白，在介导病毒与宿主受体蛋白结合、侵入及病毒与细胞膜的融合等方面发挥了关键性的作用。病毒特异性中和抗体位点主要是在E蛋白上，该位点能够诱导机体产生保护性中和抗体[7]。此外，E蛋白既含有群特异性抗原表位又含有型特异性抗原表位，还含有与中和抗体反应的抗原决定簇[8]。鉴于此，利用大肠杆菌系统表达DTMUV的E基因，以期表达出具有免疫原性的E重组蛋白，为DTMUV E蛋白结构功能研究及基因工程亚单位疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌株和载体

DTMUV奉贤株由中国上海兽医研究所惠赠；原核表达载体pET-30a由本实验室保存；E.coliDH5α和BL21(DE3)感受态细胞均购自康为世纪生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

高保真Pfu酶、T4 DNA连接酶、预染蛋白质Maker、1 kb DNA Maker、限制性核酸内切酶SacI、BamH I均购自Thermo公司；RT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自AxyPrep公司；丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、DAB显色试剂盒及抗His标签鼠单克隆抗体均购自康为世纪生物科技有限公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自Southern Biotech公司。

1.3 引物的设计与合成

参考NCBI GenBank收录的DTMUV 奉贤株E基因序列，设计1对特异性引物，分别在上、下游引物的5′端引入SacI和BamH I酶切位点。引物序列F为5′-TTAGGATCCTTCAGCTGTCTGGGGATG-3′(下划线为BamHⅠ酶切位点)，R为5′-TGAGA GCTCGGCATTGACATTTACTGC-3′(下划线为SacⅠ酶切位点)。预期扩增片段大小约1 500 bp。引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.4 DTMUV的增殖与病毒RNA的提取

取10倍稀释的鸭坦布苏原代病毒0.2 mL，经尿囊腔途径接种9日龄SPF鸡胚，于37 ℃孵化箱孵化。弃去24 h内死亡的鸡胚，收获24 h后死亡胚的尿囊液。按Trizol法抽提尿囊液总RNA，具体操作步骤参照说明书。

1.5 E基因的扩增

以提取的总RNA为模板，Oligo dT为引物，利用Invitrogen公司的RT-PCR试剂盒，将RNA反转录成cDNA。20 μL反应体系为RNA 4 μL、DEPC 7 μL、Oligo dT 1 μL、5×RTase Buffer 4 μL、RNA抑制剂1 μL、dNTP 2 μL、RTase 1 μL。反应程序设定为25 ℃ 10 min，42 ℃ 90 min，70 ℃ 10 min。以扩增的cDNA为模板，高保真PCR扩增目的E基因。50 μL反应体系为DNA 1 μL，10×Buffer 5 μL，上下游引物各2 μL，dNTP 5 μL，高保真Pfu酶1 μL，ddH2O 34 μL。反应程序设定为94 ℃ 预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 重组表达载体pET-E的构建

利用AxyPrep凝胶回收试剂盒回收E基因PCR产物，将回收的E基因PCR产物和原核表达载体pET-30 a分别用SacI和BamH I双酶切后回收，T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，37 ℃培养15 h。随机挑取单菌落，接种于含卡那青霉素(50 μg·mL-1)的LB液体培养基中培养过夜。以过夜菌为模板进行PCR扩增，将PCR初步鉴定为阳性的菌株提取质粒，用SacI和BamH I双酶切鉴定，鉴定正确的菌株送上海英潍捷基生物技术有限公司测序。

1.7 重组菌的诱导表达及SDS-PAGE分析

将测序正确的重组质粒pET-E及载体质粒pET-30a分别转化至E.coliBL21(DE3)，挑取单菌落接种于含卡那青霉素(50 μg·mL-1)的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜。次日按1∶100的比例转接至含卡那青霉素(50 μg·mL-1)的5 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r·min-1振荡培养，当菌液D600值达 0.4～1.0之间时，加入IPTG至终浓度1.0 mmol·L-1，37 ℃诱导3～5 h，离心收集菌体，溶于适量PBS中，超声波裂解菌体，取裂解后的菌液与5×loading buffer混匀，煮沸5 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

1.8 重组蛋白的Western blot鉴定

将诱导样品pET-E和pET-30a进行SDS-PAGE电泳后转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，以抗His标签鼠单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，经DAB显色后观察结果。

2 结果与分析

2.1 E基因的扩增

将E基因 PCR产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条约1 500 bp的条带(图1)，与预期目的条带大小一致。

M为Marker；1为PCR扩增产物

2.2 重组质粒pET-E的鉴定

将回收的目的基因E与载体pET-30a连接，转化至E.coliDH5α感受态细胞，经PCR筛选获得重组转化子。SacI和BamHⅠ双酶切鉴定后产生与预期条带大小一致的2条条带，分别为1 500和5 400 bp(图2)，表明E基因已成功克隆入载体pET-30a中。

M为Marker；1为pET-E的Sac I和BamH I酶切产物

2.3 SDS-PAGE分析

将测序正确的重组表达载体pET-E及载体质粒pET-30a分别转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导，重组蛋白获得较高水平表达，SDS-PAGE分析结果(图3)显示，在约63 ku处出现一条明显的特异性蛋白条带，与预期的6His-E融和蛋白大小一致，且均以包涵体形式存在。

M为Marker；1为pET-30a诱导菌裂解沉淀；2为pET-E诱导菌裂解沉淀

2.4 Western blot分析

以抗His标签的鼠单抗为一抗对表达的重组蛋白进行Western blot分析，结果显示，在分子质量约63 ku处出现了特异性条带，与预期条带大小一致，表明表达的重组蛋白具备良好的反应原性。

M为Marker；1为pET-30a诱导菌裂解沉淀；2为pET-E诱导菌裂解沉淀

3 讨论

2010年，鸭坦布苏病毒病席卷了我国整个养鸭密集地区。此后，该病每年均有爆发，已成为困扰我国养鸭业的主要疾病之一。该病目前无有效的治疗药物，因此，研制预防本病的疫苗显得尤其重要。

E蛋白是构成鸭坦布苏病毒的主要毒力抗原，具有较好的免疫原性，机体产生的病毒中和抗体主要就是由E蛋白诱导生成的[7]。对黄病毒属多数成员的研究表明，病毒感染的宿主范围、毒力大小、保护性免疫、膜融合以及组织嗜性等大多与E蛋白有着极其重要的关系。因此，进行E蛋白的克隆表达，对E蛋白结构功能研究及基因工程亚单位疫苗的研制具有重要意义。

本研究利用RT-PCR技术扩增出鸭坦布苏病毒E蛋白完整基因片段，采用pET表达系统成功构建了E蛋白的原核表达载体。对原核表达产物进行可溶性分析，结果表明，表达的E蛋白主要以包涵体的形式存在于裂解后的菌体沉淀中。表达产物进行Western blot分析，结果表明，表达的E蛋白能够与抗His标签的鼠单克隆抗体发生反应，且大小与预期一致，表明其具有较好的反应原性。下一步有必要将重组蛋白进行纯化并免疫小鼠，制备针对重组蛋白的多抗血清，以便进一步用于DTMUV E抗原的检测及功能研究。