粳恢35成熟胚的再生体系

周志淑，黄桃翠，欧阳杰*

(1.重庆市南川区农业技术推广中心, 重庆 408400； 2.重庆市农业科学院, 重庆 400000)

水稻是人类最重要的粮食作物之一，其产量和品质备受人们关注。近年来，随着生物技术科学的不断发展，采用现代生物技术中的基因工程, 将外源基因导入水稻,丰富水稻的基因型。通过转基因技术，提高水稻的抗病、抗虫、抗逆能力和稻米品质[1]的研究在国内外越来越受到重视，且已取得很多成果[2-3]。

热粳优35是最新育成的首个南方耐热杂交粳稻品种。2011年在重庆南川、永川、涪陵和梁平开展了试验与示范，总面积 16.67 hm2。在遭遇罕见高温干旱情况下，热粳优35表现出产量水平高、耐热抗旱能力强、高抗稻瘟病、品质优、机收适应性好等优点[4]。能否成功进行水稻遗传转化，在很大程度上取决于该水稻品种再生体系的建立。为了建立粳恢35水稻再生体系，本研究参考了前人设计的培养基，并在此基础上进行改良，对粳恢35成熟胚进行愈伤组织诱导及再生研究，开展本实验，可为以粳恢35成熟胚为受体进行遗传转化研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验的供试材料是粳恢35，种子由重庆中一种业有限公司提供。

1.2 培养基

1.2.1 愈伤组织诱导培养基

NMB培养基3种，N6大量+MS微量+MS铁盐+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+水解酪蛋白 1.0 g·L-1+琼脂粉 7.0 g·L-1+2,4-D 1.0/2.0/3.0 mg·L-1。

NMB+维生素B5培养基3种，在3种NMB培养基中加入维生素B55 mg·L-1。

MB培养基3种，MS大量+MS微量+MS铁盐+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+水解酪蛋白1.0 g·L-1+琼脂粉7.0 g·L-1+2,4-D 1.0/2.0/3.0 mg·L-1。

MB+维生素B5培养基3种，在3种MB培养基中加入维生素B55 mg·L-1。

1.2.2 预分化和分化培养基

预分化和分化培养基成分相同，采用 2 种培养基进行比较。一种是MS大量+MS-Fe盐+MS微量+B5有机+6-BA 2 mg·L-1+NAA 1 mg·L-1+脯氨酸500 mg·L-1+谷氨酰胺500 mg·L-1+水解酪蛋白300 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂粉8.0 g·L-1，另一种是N6大量+MS-Fe盐+MS微量+B5有机+6-BA 2 mg·L-1+NAA 1 mg·L-1+脯氨酸500 mg·L-1+谷氨酰胺500 mg·L-1+水解酪蛋白300 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂粉8.0 g·L-1。

1.2.3 壮苗培养基

壮苗培养基为1/2 MB培养基：1/2 MS大量+1/2 MS微量+1/2 MS铁盐+1/2 B5有机+蔗糖15 g·L-1+琼脂粉7.0 g·L-1。

1.3 方法

1.3.1 愈伤组织诱导

取晒干的成熟种子，去壳。将种子置于70%酒精中浸泡30 s后转入NaClO溶液(NaClO∶水为1∶2)中浸泡30 min,然后用无菌水冲洗6～9次，浸泡15 min,再用无菌水冲洗2～3次。在超净台上，将成熟胚切下，将其接种于愈伤诱导培养基中，放于26 ℃培养箱中[5]，暗培养2周后，将愈伤组织除去胚芽、胚根，进行继代培养，放于26 ℃培养箱中，暗培养。以后每2周继代1次，共继代2次。

1.3.2 分化

选取浅黄色、颗粒状、质地较坚硬密实的愈伤组织,用消毒滤纸进行1～4 d的干燥处理，然后接种到预分化培养基上,进行预分化培养, 26～28 ℃,暗培养2周；再接种到分化培养基上,进行分化培养,26～28 ℃, 每天光照16 h。

1.3.3 生根及移栽

当愈伤组织在分化培养基上产生的绿芽长到2 cm高时，小心地将绿芽转接到生根培养基上，进行生根培养，26 ℃,每天光照16 h,当根长到约3 cm,苗高12～15 cm时将培养瓶移至室外,打开瓶盖,进行炼苗,炼苗2～3 d后取出小苗,小心洗去根部培养基,移入大田。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织形成及诱导率

粳恢35在不同培养基中的出愈率有差异，表1表明，NMBD2培养基对愈伤组织的诱导率最高，达到85.1%，且愈伤组织的状态很好，颜色淡黄，结构致密。另外，除了NMBD2培养基以外，在2,4-D浓度相同的条件下，加入维生素B5的培养基，要比没加入维生素B5的培养基诱导率高，说明培养基中2,4-D浓度是控制愈伤诱导率的主要因素，但当2,4-D浓度不是最适浓度时，维生素B5也可提高愈伤诱导率。

2.2 愈伤组织的分化

愈伤组织的含水量直接影响分化率，干燥、坚硬的愈伤组织分化率较高，而含水量比较高、结构松散的愈伤组织一般很难分化。试验结果，愈伤组织干燥处理1 d效果较好，绿点出现时间较早。表2表明，2种分化培养基中，NMB培养基分化效果较好，绿苗分化率达到78.6%。

表1 不同培养基对粳恢35成熟胚诱导愈伤组织的影响

表2 不同培养基对粳恢35成熟胚分化率的影响

3 小结与讨论

对水稻愈伤组织诱导和再生影响较大的是基因型的差异，一般粳稻的培养效果较好，但在不同品种间的培养效果差异也很大。转基因技术可利用的外植体种类很多，成熟胚、幼胚和花药愈伤组织等都可以用作转基因外植体，其中成熟胚因取材方便、不受季节限制，在转基因研究中有着较为广阔的应用前景。组织培养中2，4-D浓度是形成愈伤组织的必要条件，许多研究表明，单一激素成分培养的效果较差，合理的激素配比是保证组培效果的基础。关于2，4-D与其他激素搭配使用的研究很多，结果不相一致。本实验与李玉静等[6]在诱导日本晴愈伤组织时采用2，4-D与6-BA搭配使用，显著提高了愈伤诱导率的研究成果较为一致。根据Kumar等[7]的研究，本实验的培养基中也加入了维生素B5，诱导愈伤的实验结果不太理想，可能与诱导材料基因型关系较大，维生素B5对不同基因型的水稻成熟胚的再生诱导还有待于进一步研究。

干燥处理对愈伤组织的分化起到了促进作用，干燥处理的时间控制在1 d较好，这与刘永巍等[8]的研究成果基本一致，但处理时间不宜过长，时间过长较易被污染，随着时间加长，分化效果下降，处理1 d较为适宜。