中风通脉汤调控miR-155治疗急性脑梗死的作用机制研究

赵平丽，秦合伟，吕哲

(1.驻马店市中医院，河南 驻马店 463000；2.河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450000)

急性脑梗死是临床上最常见的缺血性心脑血管疾病之一，研究发现微小RNA(miRNA)在急性脑梗死发病机制中起到重要作用[1]，微小RNA-155(miR-155)在固有免疫和适应性免疫中发挥作用，参与了急性脑梗死的发生和调控，研究发现，miR-155对Treg增殖具有调控作用，其异常表达与免疫稳态异常引发的疾病相关[2]。本研究观察中风通脉汤对miR-155调控及对调节性T细胞(Treg)表达水平的影响，研究中风通脉汤治疗急性脑梗死的作用机制，现论述如下。

1 资料与方法

1.1 病例资料

选取2015年5月—2017年5月驻马店市中医院收治的确诊为急性脑梗死的80例患者，按照随机数字表法将80例患者分为观察组和对照组，每组各40例，观察组男性患者20例，女性患者20例；年龄40～69岁，平均(48.89±6.55)岁，发病时间(15.78±3.79)h；对照组40例，男性患者21例，女性患者19例；年龄41～70岁，平均(49.01±7.46)岁，发病时间(16.04±6.35)h；两组患者在年龄、性别和发病时间等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 西医诊断标准

(1)西医诊断符合中华医学会第四次脑血管病学术会议制定的急性脑梗死诊断标准[3]；(2)患者发病时间6～72 h；(3)安静状态下发病，发病时多数无显著头痛及呕吐，经过头颅MRI或者CT证实有梗死病灶，有明显低密度改变。

1.3 中医诊断标准

中医证候诊断标准参照1996年国家中医药管理局脑病急症科研协作组制订的《中风病诊断疗效评定标准》气虚血瘀证,证见半身不遂，口舌歪斜，言语謇涩或不语，偏身麻木，面色苍白，气短乏力，口角流涎，自汗心悸，手足肿胀，舌质暗淡，舌苔薄白或白腻，脉沉缓或沉涩[4]。

1.4 纳入标准

(1)符合上述中医诊断标准和西医诊断标准；(2)经伦理委员会审查通过，患者或家属签署知情同意书。

1.5 排除标准

(1)大面积脑梗死生命体征不稳定者；(2)伴有严重的心、肝、肺、肾等原发病患者；(3)妊娠或哺乳期者；(4)不能配合本研究和治疗的患者。

1.6 治疗方法

对照组：采用抗凝、抗血小板、改善循环、营养神经、调节血脂、清除自由基和调控血压血糖等常规基础疗法[5]。

观察组：在基础治疗同时服用中风通脉汤，中风通脉汤组成：黄芪30 g，党参15 g，当归尾10 g，赤芍15 g，红花10 g，川芎10 g，桃仁10 g，地龙10 g，水蛭12 g，甘草 g，每付煎成2包，每包煎成150 mL，口服或鼻饲，每次150 mL，每日2次，2周为一疗程。两组均治疗2周后进行疗效评价。

1.7 观察指标

(1)外周血调节性T细胞(Treg)表达水平测定：采用流式细胞仪Facscalibur检测，仪器及试剂盒购自美国BD公司，采用CellQuest Pro软件进行分析[6]。

(2)采用荧光RT-PCR法检测miR-155和Foxp3 mRNA水平：抽取静脉血10 mL，肝素抗凝，采用TRIzol一步法提取总RNA，β-actin为内参物。各基因引物序列及扩增产物长度：

miR-155上游引物5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG3′，下游引物5′-GCAGGGTCCGAGGT3′；Foxp3上游引物5′-CCTGGGCTCCTCGCCTCACC3′，下游引物5′-TCTCTCTGCCCCTCACC3′；β-actin，上游引物5′-GTAAAGACCTCTATGCCA3′，下游引物5′-CCTTCACCGTCCAGTTT-3′。

(3)采用ELISA法检测血清炎性因子水平：白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)[1]。

(4)检测血浆同型半胱氨酸(HCY)、血管性假血友病因子(VWF)和a颗粒膜蛋白-140(GMP-140)等血栓相关因子水平：清晨采集空腹静脉血，离心分离血浆进行测定[7]。

(5)采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评定患者神经功能[8]，采用Barthel指数(Barthel index，BI)积分法评定日常生活能力。

(6)临床总疗效：根据NIHSS评分减少百分比进行评定：①基本痊愈：91%～100%;②显著进步：46%～90%级;③进步：18%～45%;④无效：小于17%，每组总有效率=(基本痊愈例数+显著进步例数+进步例数)/总例数[8]。

(7)并发症监测：治疗期间检测患者血、尿、大便常规及肝、肾功能。

1.8 统计学处理

所得数据采用SPSS18.0统计学软件进行分析，计量资料采用(均数±标准差)表示，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 中风通脉汤对外周血Treg表达率、FoxP3 mRNA、miR-155 mRNA表达的影响

治疗前，两组患者Treg表达率、FoxP3 mRNA、miR-155 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组患者Treg表达率、FoxP3 mRNA、miR-155 mRNA表达水平较治疗前明显降低(P<0. 05)，观察组患者降低程度明显大于对照组(P<0. 05),见表1。

表1 中风通脉汤对外周血Treg表达率，FoxP3 mRNA，miR-155 mRNA表达的影响

注：与本组治疗前比较，*P<0.05；与对照组治疗后比较，▲P<0.05

2.2 中风通脉汤对血清IL-10、TNF-α、IL-6水平的影响

治疗前，观察组和对照组的血清IL-10、TNF-α、IL-6水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组患者血清IL-10、TNF-α、IL-6水平较治疗前均明显降低(P<0.05)，且观察组的降低程度大于对照组(P<0.05)。具体见表2。

表2 中风通脉汤对血清IL-10、TNF-α、IL-6水平的影响

注：与本组治疗前比较，*P<0.05；与对照组治疗后比较，▲P<0.05

2.3 中风通脉汤对Hcy、VWF和GMP-140等血栓相关因子水平的影响

治疗前，两组患者间血浆Hcy、VWF和GMP-140等血栓相关因子水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组患者血浆Hcy、VWF和GMP-140水平均明显降低(P<0.05)，且观察组的改善程度优于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 中风通脉汤对Hcy、VWF和GMP-140等血栓相关因子水平的影响

注：与本组治疗前比较，*P<0.05；与对照组治疗后比较，▲P<0.05

2.4 两组患者NIHSS积分和BI积分比较

治疗前，两组患者间NIHSS积分和BI积分比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组患者NIHSS积分和BI积分较治疗前明显改善(P<0.05)；观察组NIHSS评分和BI积分改善程度优于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 两组患者间NIHSS积分和BI积分比较分)

注：与本组治疗前比较，*P<0.05；与对照组治疗后比较，▲P<0.05

2.5 两组患者临床总有效率比较

观察组患者总有效率96.00%明显优于对照组86.00%(P<0.05)。见表5。

表5 两组患者临床总有效率比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05

2.6 并发症监测

治疗期间未发现血、尿、大便常规及肝、肾功能异常。

3 讨论

急性脑梗死是由于脑血管闭塞引起的颅内相应供血部位的脑组织缺血缺氧性坏死，进而引起患者肢体功能障碍，研究发现，急性脑梗死与炎症反应密切相关，血清TNF-α水平与脑梗死的面积大小成正比，IL-10和IL-6在动脉粥样硬化和脑梗死继发脑损伤发生中具有重要意义[9-10]。研究发现，急性脑梗死可能处于免疫反应亢进，免疫抑制和促炎、抗炎反应的动态演变之中，急性脑梗死患者外周血Treg，FoxP3 mRNA表达及相关因子血清IL-10、TNF-α、IL-6水平显著高于正常人，miR-155调控急性炎症和Treg增殖的双重作用，起到一定的免疫抑制作用，miR-155表达增加促使机体炎症反应，效应性T细胞和特异性抗体的产生，在特异性免疫和固有免疫中起到关键性作用，参与了急性脑梗死的炎性反应，FoxP3是Treg最关键及特异性的转录因子，能够结合在体内miR-155的mRNA的一个内含子上，并分泌多功能的细胞因子IL-10，其能够抑制趋化因子及炎症因子TNF-α、IL-6的产生，是一个具有独特免疫调节功能及诱导免疫耐受的T细胞亚群，由此可见，miR-155是急性脑梗死患者免疫失调的调控网络中的一个位点[6]。

研究发现，同型半胱氨酸(HCY)代谢异常能够直接损害血管内皮细胞功能，导致胆固醇以及脂蛋白在血管壁沉积，促进动脉粥样硬化和血栓的形成[11]。研究发现，血浆血管性假血友病因子(VWF)水平与血管内皮细胞受损以及血小板黏附性密切相关，血浆a颗粒膜蛋白-140(GMP-140)是血栓前状态和血栓形成的标志物，VWF和GMP-140均在凝血反应中起重要作用[12]。

脑梗死在中医学中属“中风”范畴，患者多因正气亏虚，复因劳欲过度阴阳失调、气血逆乱，产生风、火、痰、瘀，上犯于脑，脑脉痹阻，病机气虚为本，瘀阻为标，气血运行不利，导致脑脉痹阻，以气虚血瘀为主要证型。中风通脉汤由补阳还五汤加减化裁而来，经过脑病科多年的临床实践证实疗效可靠，是本院治疗急性脑梗死的主要方剂，中风通脉汤方中重用黄芪和党参补气，当归尾和赤芍活血祛瘀通络，川芎性味辛温，能活血行气，祛风止痛，桃仁破血祛瘀，红花活血通经，祛瘀止痛，地龙和水蛭破血通络除痹，甘草调和诸药。诸药共奏补气扶正、温经化瘀、消栓通络之功。

本研究观察中风通脉汤对气虚血瘀型急性脑梗死患者的临床疗效，并研究其作用机制。结果显示，经中风通脉汤治疗后，观察组患者miR-155、Foxp3 mRNA表达水平和IL-10、TNF-α、IL-6水平较治疗前和对照组治疗后明显降低，Hcy、VWF和GMP-140血栓相关因子水平较治疗前和对照组治疗后明显降低，患者NIHSS积分和BI积分较治疗前明显改善，观察组临床总有效率明显优于对照组。研究结果表明，中风通脉汤治疗气虚血瘀型急性脑梗死，能够改善血清炎性因子水平，降低血栓相关因子水平，减轻脑组织损伤和神经功能缺损；这可能与其通过调控miR-155，进而调节Treg增殖，降低IL-10、TNF-α、IL-6水平有关，本研究为中医药治疗急性脑梗死患者的作用机制研究提供了一定的依据。