安徽不同产地芝麻中木酚素和总酚含量及芝麻提取物抗氧化能力比较

朱秀灵，戴清源，木朝丽，蔡为荣，郭玉宝，许祚文，张志祥，汪建飞（.安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖 4000；.芜湖益然香木榨食用油有限公司，安徽芜湖 400）

0 引言

芝麻（Sesamum indicum L.）是最古老的油料作物之一，富含油脂（50%以上）、蛋白质（约25%）及抗氧化物质，如芝麻素、芝麻林素、生育酚等。除被用于生产芝麻油外，也广泛用于糖果糕点、焙烤食品，在医药领域也有潜在的应用前景[1-2]。

长期以来，芝麻深受消费者青睐与其对人体的营养健康作用密不可分。芝麻木酚素是芝麻中最有营养价值的成分之一，具有促进乙醇代谢、肝解毒、调节血脂、降血压、抗氧化及抗癌等生理活性[3-4]。因此，高含量的芝麻木酚素通常被作为芝麻品种选育的指标之一。芝麻木酚素包括脂溶性的芝麻素、芝麻林素及水溶性的芝麻素酚三糖苷、二糖苷、单糖苷等，其中以芝麻素（0.67～12.76 mg/g）、芝麻林素（0.20～6.96 mg/g）、芝麻素酚三糖苷 （0.68～6.40 mg/g）含量居高[4-8]。芝麻木酚素含量因地区、品种、颜色等因素的影响而有很大差异[8]。此外，芝麻中天然存在的木酚素及酚类物质是否与芝麻抗氧化能力相关，近年来也引起众多学者的广泛关注。研究发现，黑芝麻抗氧化能力强于白芝麻，但是抗氧化能力的强弱与芝麻素、芝麻林素含量之间没有相关性[2，9]；芝麻素在体外的抗氧化能力较弱，但芝麻素的存在增强了γ-生育酚的抗氧化活性[10]；芝麻抗氧化活性与芝麻中酚类物质可能有一定的关系[11]。芝麻抗氧化能力与芝麻木酚素含量及总酚含量是否相关尚需进一步研究。

我国是芝麻生产及消费大国，安徽省是芝麻种植面积较大的省份之一，芝麻种植面积和产量仅次于河南省，居全国第2位[12]。目前，有关安徽不同产地芝麻中木酚素含量、总酚含量及抗氧化能力的研究报道较少。以安徽不同产地芝麻为原料，测定芝麻中木酚素及总酚含量、评价芝麻提取物的抗氧化能力、探讨芝麻木酚素及总酚含量与抗氧化能力之间的相关性，对于正确认识芝麻活性成分的保健作用并合理利用芝麻资源具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料：分别于2016年7月—12月购买安徽不同产地农户自行种植的芝麻共22份，日光晒至水分含量5.5%～6.0%，密封袋密封，于-18℃条件下存放。

试剂：没食子酸（99%纯度）、甲醇（色谱纯）、福林酚试剂（BR级），国药集团化学试剂有限公司提供；2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）、芝麻素、芝麻林素标准品（HPLC纯度98%以上），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；芝麻素酚三糖苷标准品，实验室自制，HPLC纯度98%以上。

1.2 仪器与设备

FW-100型万能粉碎机、SHA-S型往返式气浴恒温振荡器，金坛市杰瑞尔电器有限公司产品；L-550型台式低速大容量离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司产品；SHZ-Ⅲ型多功能循环水真空泵，郑州上街华科仪器厂产品；ZFD-A5140型鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司产品；UV-5800PC型双光束紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；LC-2010型液相色谱仪，日本岛津公司产品；IMark酶标仪，美国BioTek公司产品。

1.3 芝麻提取物的制备

芝麻经日光晒干（水分含量5.5%～6.0%），经万能粉碎机粉碎，过60目筛。按料液比1∶10（g∶mL）加入90%甲醇，于气浴振荡器中于室温下振荡浸提3 h，离心（4 500 r/min，10 min），收集浸提液，沉淀部分以相同方法浸提2次，将3次浸提液混合并减压浓缩、真空干燥，即得芝麻提取物。称取22份芝麻提取物各10 mg用90%甲醇溶解并定容至10 mL，经0.45 μm滤膜过滤，滤液分别用于木酚素、总酚含量和抗氧化能力分析。

1.4 芝麻中木酚素含量的测定

木酚素含量的测定采用高效液相色谱法，色谱条件如下：TSKgel ODS-80TsQA型（4.6 mm×250 mm）色谱柱，紫外检测器，检测波长290 nm，流动相：甲醇/水由初始10/90（mL/mL） 在60 min梯度变化为90/10（mL/mL），流速0.8 mL/min，柱温35℃，进样量20 μL，每个样品检测时间70 min。

精确称取芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚三糖苷标准品各10 mg，芝麻素和芝麻林素分别用甲醇溶解并定容至25 mL，芝麻素酚三糖苷用90%甲醇溶解并定容至25 mL，分别得到400 μg/mL标准品母液。然后将标准品母液分别稀释得到质量浓度为5，20，40，80，100 μg/mL的标准溶液，并分别进行高效液相色谱检测。以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

芝麻木酚素含量采用高效液相色谱检测，根据保留时间是否与标准品一致进行定性分析，根据木酚素对应的峰面积，由标准曲线计算得出待测溶液中各木酚素质量浓度。芝麻中芝麻素、芝麻林素及芝麻素酚三糖苷的含量分别按公式（1）计算。芝麻总木酚素含量为三者之和。

式中：ω——分别表示芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷的含量，mg/g；

C——分别表示待测液中芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷的质量浓度，μg/mL，由对应的标准曲线获得；

V——待测液的体积，mL；

m0——芝麻质量，g。

1.5 芝麻中总酚含量的测定

总酚含量的测定采用福林酚法[13]，准确量取芝麻提取物各0.5 mL，分别加入1.0 mL 0.1mol/L福林酚试剂，混匀，再加入4.0 mL饱和碳酸钠溶液，混匀，避光静置2 h，于波长765 nm处测定吸光度。以没食子酸（GAE）为标准，总酚含量以每克芝麻提取物含有没食子酸毫克数（mg GAE/g）表示。

1.6 芝麻提取物抗氧化能力

芝麻提取物抗氧化能力参照文献[14]，方法如下：精确称取10.0 mg DPPH自由基，用甲醇溶解并定容于25 mL棕色容量瓶中，然后用甲醇稀释配成浓度为1×10-4mol/L DPPH自由基溶液，于4℃冰箱中避光保存。将芝麻提取物分别用90%甲醇稀释至质量浓度为100 μg/mL，各量取30 μL，分别加入到96孔板中，每孔再分别加入240 μL甲醇和30 μL DPPH自由基溶液，混匀，于室温下避光静置30 min，然后用酶标仪于波长540 nm处测定吸光度。空白以90%甲醇取代样品，则芝麻提取物对DPPH自由基清除率：

式中：d——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白对照于波长540 nm处吸光度；

Asample——待测样品于波长540 nm处吸光度。

1.7 数据分析

采用SPSS V22.0（IBM-SPSS，USA） 软件进行数据整理、制图、方差分析和显著性检验，试验均重复3次，结果以平均值±标准偏差（X±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 安徽不同产地芝麻中木酚素含量比较

芝麻林素、芝麻素、芝麻素酚三糖苷及芝麻提取物的高效液相色谱图见图1。

图1 芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷及芝麻提取物的高效液相色谱图

以峰面积Y为纵坐标、质量浓度X为横坐标，绘制标准曲线，分别得到芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚三糖苷的标准曲线Y=37.167X-11.392（R2=0.998 6），Y=31.642X-20.491 （R2=0.998 9）， Y=11.093X+18.076（R2=0.997 8），线性范围 5～100 μg/mL。由公式（1）计算得出安徽不同产地芝麻中芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚三糖苷含量。

芝麻中木酚素、总酚含量及芝麻提取物对DPPH自由基的清除能力见表1，黑白2组芝麻木酚素、总酚含量及芝麻提取物对DPPH自由基的清除能力见表2。

表1 芝麻中木酚素、总酚含量及芝麻提取物对DPPH自由基的清除能力

表2 黑白2组芝麻木酚素、总酚含量及芝麻提取物对DPPH自由基的清除能力

由表1和表2可知，安徽不同产地芝麻中芝麻素含量范围2.16～7.37 mg/g，芝麻林素1.09～3.73 mg/g，芝麻素酚三糖苷 0.46～2.76 mg/g，总木酚素 3.93～12.43 mg/g，平均含量分别为4.64±1.65，2.50±0.78，1.78±0.65，8.87±2.86 mg/g。芝麻素、芝麻素酚三糖苷的平均含量均高于文献[15]芝麻素含量380.6±20.4 mg/100 g，芝麻素酚三糖苷含量68.4 mg/100 g以及文献芝麻素含量4.34 mg/g和芝麻素酚三糖苷含量1.09 mg/g，但低于文献[7]芝麻素5.24 mg/g及文献[2]芝麻素酚三糖苷640±317 mg/100 g。研究中芝麻林素平均含量2.50±0.78 mg/g低于文献[15]（276.5±13.8 mg/100 g），文献[7]（3.30 mg/g） 但高于文献[2]（2.27 mg/g） 报道。

黑白2组芝麻相比，白芝麻中芝麻素含量范围4.47～7.37 mg/g（平均含量为 5.91±0.90 mg/g），芝麻林素 2.37～3.33 mg/g（平均含量为 2.90±0.32 mg/g），芝麻素酚三糖苷1.72～2.61 mg/g（平均含量为2.19±0.30 mg/g），总木酚素9.61～12.32 mg/g（平均含量为11.01±0.83 mg/g）；而黑芝麻中这几种木酚素含量范围分别为 2.16～5.94，1.09～3.37，0.46～2.76，3.93～12.43 mg/g，平均含量分别为3.36±1.15，2.10±0.89，1.36±0.65，6.73±2.53 mg/g。Rangkadilok N 等人[4]分析泰国黑芝麻和白芝麻中芝麻素含量分别为0.05～4.71 mg/g 和 0.74～7.23 mg/g，其中芝麻素含量最高的品种是中国白芝麻；与白芝麻相比，泰国黑芝麻中芝麻林素含量较低，不超过1.28 mg/g。试验中黑芝麻各木酚素平均含量均低于白芝麻，这与文献[2，7]报道基本一致。

黑白2组芝麻中木酚素、总酚含量及芝麻提取物对DPPH自由基清除能力方差分析见表3。

由表3可知，黑白2组芝麻中芝麻素、芝麻素酚三糖苷及总木酚素含量差异极显著（p＜0.01），芝麻林素含量差异显著 （0.01＜p＜0.05），这与文献[2，7]报道基本一致。黑白芝麻木酚素含量差异可能与品种、遗传因素、生长环境（土壤、气候、光照、肥料）、粒径大小、蒴果分布、收获时间、贮藏时间、提取溶剂及检测方法等因素有关[2，4]。

表3 黑白2组芝麻中木酚素、总酚含量及芝麻提取物对DPPH自由基清除能力方差分析

芝麻中木酚素含量、总酚含量及芝麻提取物对DPPH自由基清除能力相关性分析见表4。

由表4可知，芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷与总木酚素含量之间的相关系数分别为0.957，0.872，0.867，在0.01水平上显著；芝麻素与芝麻林素、芝麻素与芝麻素酚三糖苷、芝麻林素与芝麻素酚三糖苷之间的相关系数分别为0.722，0.740，0.799，在0.01水平上显著。结果表明，安徽不同产地22种芝麻中各木酚素含量之间显著正相关，这与文献[5]报道的芝麻素和芝麻林素含量呈显著正相关基本保持一致，其原因在于芝麻素和芝麻林素具有相似的生物合成途径，但文献却报道芝麻中各木酚素含量之间没有相关性。

表4 芝麻中木酚素含量、总酚含量及芝麻提取物对DPPH自由基清除能力相关性分析

2.2 安徽不同产地芝麻中总酚含量比较

芝麻中总酚含量采用福林酚法测定（见表1）。采用SPSS V22.0软件对表1数据比较均值（见表2）及方差分析（见表3）。由表2可知，芝麻中总酚含量为 3.13～3.97 mg GAE/g，平均含量为 3.60±0.28 mg GAE/g；黑白2组芝麻中总酚含量分别为3.13～3.95，3.25～3.97 mg GAE/g，平均含量分别为3.49±0.30，3.71±0.22 mg GAE/g，黑白2组芝麻中总酚含量差异不显著（p=0.068＞0.05），说明黑白2种颜色芝麻中总酚含量没有明显差异。安徽地区白芝麻中总酚含量变化范围大于Lin X等人报道的范围3.70～7.86 mg GAE/g，其原因可能与芝麻品种、生长环境及提取检测条件有关。研究中黑白2组芝麻中总酚含量没有显著差异，这与Shahidi F等人[9]报道不一致，他们采用80%乙醇浸提黑芝麻和白芝麻，所得提取物中总酚含量分别为29.9±0.6，10.6±1.6 mg/g（以每1 g提取物中毫克儿茶素当量计），黑芝麻提取物中总酚含量约是白芝麻的5倍。然而通过比较山西省3种黑芝麻和白芝麻总酚含量，黑白芝麻中总酚含量分别为 4.54～7.32 mg GAE/g，3.56～4.04 mg GAE/g，白芝麻中总酚含量高于黑芝麻，但二者之间差异不显著。

2.3 安徽不同产地芝麻提取物对DPPH自由基清除能力比较

DPPH自由基比羟基自由基和超氧自由基更加稳定[10]，因此DPPH自由基清除能力常被用作评价抗氧化能力的一种方法。研究采用DPPH自由基清除能力评价安徽不同产地芝麻提取物的抗氧化活性，结果见表1和表2。22种芝麻提取物对DPPH自由基清除率范围为65.34%～81.44%，黑白2组芝麻提取物对DPPH自由基清除率范围分别为65.34%～81.44%和66.42%～79.19%，2种颜色相比，黑芝麻提取物对DPPH自由基清除率范围及平均清除率均大于白芝麻，但差异不显著（p=0.680＜0.05，见表3）。这可能是由于提取溶剂、芝麻品种及生长环境条件不同，芝麻提取物中抗氧化物质含量不同，对DPPH自由基清除能力也会有所不同[2]。

众多学者认为芝麻提取物的抗氧化活性与抗氧化成分（如芝麻素、芝麻林素及酚类物质）有关，但也有研究报道芝麻提取物的抗氧化活性与芝麻木酚素含量没有直接关系[2]。研究针对DPPH自由基清除能力是否与芝麻木酚素及总酚含量相关进行了分析（见表4）。由表4可知，芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷及总木酚素含量与DPPH自由基清除率之间的相关系数分别为0.228，0.319，0.279，0.289，在0.05及0.01水平均不显著，说明芝麻中各木酚素与DPPH自由基清除能力没有相关性，这与Kumar C M等人[10]报道基本一致。芝麻中总酚含量与DPPH自由基清除率之间的相关系数为0.543，在0.01水平显著，说明芝麻中总酚含量与DPPH自由基清除能力显著相关，这与文献[11]报道一致。

3 结论

采用HPLC法测定安徽不同产地22种芝麻中芝麻素、芝麻林素及芝麻素酚三糖苷含量，采用福林酚法测定芝麻中总酚含量、DPPH自由基清除活性评价芝麻提取物的抗氧化能力。22种芝麻中芝麻素、芝麻林素及芝麻素酚三糖苷含量分别为2.16～7.37，1.09～3.73，0.46～2.76 mg/g。黑白 2 组芝麻相比，黑芝麻中芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷及总木酚素含量显著低于白芝麻，各木酚素含量之间呈显著正相关。22种芝麻中总酚含量为3.13～3.97 mg/g。黑白2组芝麻相比，总酚含量差异不显著。芝麻中总酚含量与各木酚素含量呈显著正相关。22种芝麻提取物对DPPH自由基清除率为65.34%～81.44%，黑芝麻提取物对DPPH自由基清除能力高于白芝麻提取物，但差异不显著。22种芝麻提取物对DPPH自由基清除能力与各木酚素含量无相关性，但与芝麻中总酚含量呈显著正相关。

芝麻作为传统健康食品，深受消费者青睐，其健康作用与木酚素含量、总酚含量及芝麻提取物的抗氧化能力是否相关，一直备受关注。由于芝麻品种、生长环境、气候条件、田间管理、贮藏时间等因素的影响，芝麻木酚素及总酚含量可能存在不同程度的差异。目前，抗氧化能力体外测定常用方法主要有以脂质氧化降解为基础的方法（如过氧化值法、硫代巴比妥酸反应物法、硫氰酸铁法等）、以清除自由基为基础的方法（如DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子等清除能力）、螯合过渡金属防止产生自由基的方法（如铁离子螯合能力、铜离子螯合能力等）、测定待测物的还原能力的方法（如铁离子还原能力、铜离子还原能力）及其他方法（如电化学法、高效液相色谱法等）[16]。由于没有统一的标准方法，所以在研究物质的抗氧化能力时，所采用的方法因研究者偏好及试验条件的影响而不同。与羟基自由基、超氧自由基相比，DPPH自由基稳定[10]，因此DPPH自由基清除能力常被用作评价抗氧化能力的一种方法，这也是试验采用DPPH自由基清除活性评价芝麻提取物的抗氧化能力的原因之一，但也存在着方法单一、测定结果不能与其他测定方法相比较等问题，因此有关芝麻提取物的抗氧化能力有待于结合多种测定方法进一步深入研究。