超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中孔雀石绿及其代谢物的残留量

林功师

(厦门市海洋与渔业研究所，福建 厦门 361008)

孔雀石绿(Malachite green，MG)，学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，是一类人工合成的三苯基甲烷类碱性染料，工业上常用于纸张、丝绸和皮革的染色[1]；在水产养殖业中常用于预防和治疗各类水生动物病害，特别是鱼类的小瓜虫病、鳃霉病和水霉病等[2]。因孔雀石绿在治疗水霉病方面具有很好的作用，而曾常用在水产养殖、水产品的运输和水产品暂养等过程，以延长水产品特别是鱼类的存活时间。大量的研究结果显示，孔雀石绿进入动物机体后，会通过代谢作用生成脂溶性的隐色孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG)[3]。孔雀石绿和隐色孔雀石绿都具有致畸、致癌和致突变等毒副作用，由于隐色孔雀石绿不易溶于水，其残留毒性比孔雀石绿更大，它们通过食物链的富集和传递，最终会进入到人体，严重威胁人类的身体健康[4-6]。目前，孔雀石绿已被美国、欧盟、日本、韩国等许多国家和地区列为禁止使用的兽药，我国于2002年将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，要求在肉类产品中均不得检出[7-8]。由于市场上还没有售价低、安全可靠、药效又好的药品能代替孔雀石绿，所以孔雀石绿在水产养殖业中的使用依然存在，且屡禁不止。因此，检验检测机构建立准确、灵敏、快速的检测方法在实际检测工作中具有重要意义。

目前检测水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿残留的方法主要有胶体金免疫层析法[9]、高效液相色谱法[10-11]、液相色谱质谱联用法[12-13]等。本研究依据GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》[14]的方法，建立了样品经乙腈提取和中性氧化铝小柱净化，同位素内标法定量，用UHPLC-MS/MS法测定鱼肉中孔雀石绿及其代谢物残留量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

超高效液相色谱(1290 Infinity UHPLC，美国 Agilent 公司)；三重四级杆串联质谱仪(AB SciexTriple Quad 4500，美国AB公司，配有电喷雾 ESI 离子源)； MS3 Digital 漩涡振荡器(德国IKA公司)；BS110S电子天平和TE212电子天平(德国Sartorius公司)；R-100旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；Sorvall Stratos高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；Milli-Q Gradient超纯水仪(美国Millipore公司)；Multi 9310台式pH分析仪(德国WTW公司)；50 μL、100 μL、1 000 μL移液器(法国Gilson公司)。

甲醇、二氯甲烷、乙腈、无水乙酸等试剂均为色谱纯；乙酸铵缓冲溶液(5 mmol/L)；乙酸铵缓冲溶液(0.1 mol/L，用乙酸调至pH=4.5)；盐酸羟胺溶液(0.25 g/mL)；对-甲苯磺酸溶液(1.0 mol/L)；中性氧化铝柱(1 g/3 mL)；孔雀石绿草酸盐和隐色孔雀石绿购自德国Dr.Ehrenstorfer，纯度均大于98%；氘代孔雀石绿(MG-D5)和氘代隐色孔雀石绿(LMG-D6)购自 WITEGA纯度均大于98%。

1.2 样品

实验用的6种鱼类样品为采购于水产批发市场的罗非鱼(Oreochromismossambicus)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、鳜鱼(Sinipercachuatsi)、金鲳鱼(Trachinotusovatus)、乌鳢(OphiocephalusargusCantor)。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别准确称取MG、LMG、MG-D5和LMG-D6标准品5.0 mg(精确至0.1 mg)，用少量乙腈溶解，然后转移至5 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 000.0 μg/mL的标准储备液，于-18℃保存。分别用乙腈将标准储备液稀释成浓度为1.0 μg/mL的标准中间液。从MG和LMG标准中间液取适量配制成100.0 ng/mL的混合标准工作液；从MG-D5和LMG-D6标准中间液取适量配制成100.0 ng/mL的混合同位素内标工作液，于-18℃保存。

分别移取适量100.0 ng/mL的混合标准工作液和50 μL 100.0 ng/mL的混合同位素内标工作液，并用乙腈和5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)(3∶7，V/V)溶液配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的混合标准工作曲线，其中内标含量均为5.0 ng/mL。

1.3.2 仪器条件

色谱柱为Zorbax Eclipse Plus-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相A为乙腈，流动相B为5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)；柱温40℃；流速0.35 mL/min；进样量10 μL；液相色谱流速及梯度洗脱程序见表1。离子源为电喷雾离子源ESI，毛细管电压为5 500 V，离子源气流量为25.0 mL/min，锥孔气流量50.0 mL/min。采用正离子扫描方式(ESI+)，多反应监测模式(MRM) 。质谱定性定量离子对信息见表 2。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

续表1

注：流动相A为乙腈；流动相B为5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)。

Notes：The mobile phase A was acetonitrile，while the mobile phase B was ammonium 5 mmol/L acetate aqueous solution(added 0.1% formic acid).

表2 目标化合物液质测定条件

注：*为定量离子。

Note：*represented the quantitation ion.

1.3.3 样品处理

提取：称取5.00 g已捣碎样品，精确至0.01 g于50 mL离心管中，加入100 ng/mL内标工作溶液50 μL，0.25 g/mL盐酸羟胺溶液2 mL，1.0 mol/L对-甲苯磺酸溶液2 mL，0.1 mol/L乙酸铵溶液(用乙酸调至pH=4.5)2 mL，乙腈10 mL涡旋振荡1 min，再加入5 g酸性氧化铝，涡旋振荡1 min，13 000 r/min离心4 min。将上层清液转移至另一支50 mL离心管中；残渣再加入10 mL乙腈振荡2 min，13 000 r/min离心4 min，合并上清液；往上清液的离心管中加入10 mL二氯甲烷和5 mL水，涡旋振荡2 min，13 000 r/min离心4 min。移取下层有机层至含有5 g无水硫酸钠并用5 mL乙腈润洗的漏斗中，漏斗下方放置100 mL鸡心瓶收集提取液，重复萃取一次，合并全部提取液于鸡心瓶中，然后用5 mL乙腈将残留在无水硫酸钠中的目标物冲洗至鸡心瓶中。摇匀后，将鸡心瓶于35℃下旋转浓缩至近干。

将中性氧化铝柱安装在固相萃取装置上，用5 mL乙腈活化柱子。鸡心瓶中的残渣用2 mL乙腈溶解，超声2 min，然后将溶液移至柱子上，再用2 mL乙腈溶解鸡心瓶中的残渣两次，依次过柱，收集洗脱液，35℃下旋转浓缩至干，用1.0 mL乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)(3∶7，V/V)溶液定容，过0.22 μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

2 结果与分析

2.1 色谱与质谱图

在流动相中加入适量低浓度的挥发性缓冲盐和甲酸，可以使目标物在离子化过程中改善峰形、提高灵敏度和获得更丰富的离子碎片信息。因此，本研究采用乙腈和5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)作为流动相体系。结果表明，当乙腈和乙酸铵溶液按初始比例为30∶70 的梯度洗脱条件时，孔雀石绿、隐色孔雀石绿的分离效果好，峰形对称尖锐，5 min完成检测。目标物混合标准溶液的TIC图和MRM色谱图如图1所示。

注：1是氚代孔雀石绿；2是氚代隐色孔雀石绿；3是孔雀石绿；4是隐色孔雀石绿。

Notes：1(MG-D5，Rt：2.28 min)；2(LMG-D6，Rt：3.70 min)；3(MG，Rt：2.29 min)；4(LMG，Rt：3.74 min).

2.2 方法的线性范围、检出限

浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的混合标准工作曲线，其中内标含量均为5.0 ng/mL的测定结果见表3。由表3可知，MG和LMG在0.5～20.0 ng/mL浓度范围内，线性关系良好，相关系数均大于0.999。检出限以在阴性样品中依次添加不同浓度的混合标准溶液后进行测定的各化合物定量离子信噪比S/N≥3定义，在0.05 μg/kg添加水平时，孔雀石绿、隐色孔雀石绿定量离子信噪比均大于3，故将其定为检出限，其能够满足国标GB/T 19857—2005的检测要求。

表3 MG 和 LMG 的回归方程以及相关系数

2.3 回收率和精密度

选用罗非鱼、草鱼、大菱鲆、鳜鱼、金鲳鱼和乌鳢作为基质样品，往称取的5.00 g捣碎样品中分别加入25、50、100 μL 100 ng/mL的混合标准工作液和50 μL 100 ng/mL的混合内标工作液，按1.3.3样品处理步骤进行0.5、1.0、2.0 μg/kg 3个水平的加标回收实验，每个加标水平进行6次重复实验，测定结果见表4、表5。从表4、表5可以看出，鱼肉中孔雀石绿的加标回收率在83.6%～102.7%之间，相对标准偏差(RSD，n=6) 为 3.41%～6.88%；隐色孔雀石绿的加标回收率在81.3%～103.3%之间，相对标准偏差(RSD，n=6) 为 3.68%～7.61%。由此可见，本研究所建立的实验方法具有较好的准确度和精密度，能够满足检测任务的需要。

表 4 样品中孔雀石绿(MG)回收率和精密度(n=6)

表 5 样品中孔雀石绿(LMG)回收率和精密度(n=6)

2.4 实际样品测试

采用建立的检测方法，对40份鱼类样品进行了孔雀石绿和隐色孔雀石绿的检测，均未检出孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留。此外，运用本方法对能力验证鱼样中的孔雀石绿和隐色孔雀石绿含量进行检测，测得样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的含量分别为1.89 μg/kg和6.71 μg/kg，与实际值的偏差分别为-0.11 μg/kg和-0.29 μg/kg，获得满意的结果。

3 讨论

3.1 提取过程的改进

本研究将GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法中需用匀浆机匀浆过程优化为采用涡旋振荡匀浆，这样既可以避免匀浆机匀浆后样品残留在刀头上造成损失，又提高了样品的提取速度，节约实验时间。

此外，GB/T 19857—2005方法中使用分液漏斗进行液液萃取，存在分层时间长、易产生乳化、乳化层含水量高等不利后续实验进行的情况。本研究将使用分液漏斗进行液液萃取优化为离心管涡旋振荡后低温高速离心，并用无水硫酸钠进行除水的实验方式，很大程度上避免了乳化情况的出现，也大大地节约了实验的时间。

3.2 实验试剂使用量的改进

GB/T 19857—2005方法中提取过程乙腈的使用量为60 mL，二氯甲烷的使用量为50 mL，存在使用有毒试剂量较大、耗时较长的情形[15]。本研究通过优化实验过程，乙腈的使用量为30 mL，二氯甲烷的使用量为20 mL，大大降低了有机溶剂的使用量，不但降低了实际检测成本，减少有机废液的产生量，还能缩短旋转蒸发的时间，提高实验效率。

3.3 净化方法的改进

隐色孔雀石绿具有很强的亲脂性，鱼肉样品基质复杂，脂肪含量较高，不利于孔雀石绿和隐色孔雀石绿的提取和净化，容易在测定过程中产生离子抑制，因此有必要在前处理过程中将溶液中的脂肪去除。常用的净化柱为酸性氧化铝小柱、中性氧化铝小柱、碱性氧化铝小柱、酸性氧化铝柱+丙磺酸PRS柱组合等[16-17]。因用乙腈活化过的酸性氧化铝对脂肪的吸附能力弱、除脂能力弱，而碱性氧化铝则对目标物孔雀石绿具有一定的吸附能力，造成孔雀石绿损失。所以，本研究采用中性氧化铝小柱进行净化处理，既能有效去除脂肪，又能避免对目标化合物的吸附。

4 结论

本研究在GB/T 19857—2005方法的基础上，通过优化样品前处理条件和色谱质谱条件，对鱼肉样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的残留量进行检测。结果表明，孔雀石绿和隐色孔雀石绿在0.5～20.0 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。样品加标量在0.5、1.0、2.0 μg/kg三个水平的加标回收率在81.3%以上，相对标准偏差均小于10%，而且优化后的方法缩短了实验时间、减小了实验试剂的使用量，提高了实验的效率，能够较好地满足实际检测工作的需要。