实验猴沙门菌可视环介导等温扩增检测方法的建立及应用

温和心，龙英全，蒋荣华，盘宝进，罗广生 ，陈立军

(1.贵港出入境检验检疫局,广西贵港 537100； 2.灵长类实验动物国家重点实验室,广西南宁 530028；3.玉林出入境检验检疫局,广西玉林 530000)

沙门菌(Salmonella)是一种在世界范围内广泛流行的人畜共患病病原菌，能致人和多种动物发生胃肠炎、伤寒、败血症等[1-2]，因此受到世界各国的高度关注，该菌与人们日常生活关系密切。流行病学研究表明，该菌在我国的分布非常广，从人群、动物、外环境和食品都可以分离到沙门菌[3-5]，是实验猴贸易必检项目之一，我国是实验猴出口大国，沙门菌检疫工作受到高度重视。对该细菌主要以分离培养方法进行检验，沙门菌培养过程中大量杂菌会把目的菌落覆盖，较难找出典型菌落，所以检出率一直较低，无法满足检疫要求。可视环介导等温扩增是在环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)体系中加入指示剂，可以直观地目测反应结果，既免除了产物电泳步骤，又减少了产物污染，克服了LAMP产物易污染的缺点，更好地发挥了LAMP技术的优势。本研究将可视LAMP技术应用于沙门菌的快速检测，对解决当前检疫难题，促进实验动物检疫技术水平提升有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 本实验室保存的伤寒沙门菌CMCC50039、甲型副伤寒沙门菌CMCC50093、乙型副伤寒沙门菌CMCC 50094、肠炎沙门菌CICC21482、鼠伤寒沙门菌CICC10420、大肠埃希菌ATCC25922、痢疾志贺菌ATCC51252、小肠结肠炎耶尔森菌CMCC5220、空肠弯曲菌ATCC33291、溶血性链球菌CMCC32121、粪链球菌ATCC29212、李斯特菌ATCC19111、粪肠球菌ATCC35667、金黄色葡萄球菌ATCC6538、表皮葡萄球菌ATCC12228、铜绿假单胞菌ATCC27853、产气荚膜梭菌ATCC13124、阪崎肠杆菌ATCC29544、奇异变形杆菌ATCC25933、蜡样芽胞杆菌CMCC63301、绿脓杆菌ATCC15442、副溶血性弧菌 ATCC17802、肺炎克雷伯菌CMCC46117。

1.1.2 试剂与设备 DNA大片段聚合酶Bst试剂盒，NEB公司产品；荧光PCR试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司产品；PCR试剂盒、脱氧核苷酸(dNTP)，天根生化科技有限公司产品；羟基萘酚蓝(HNB)、甜菜碱(betaine)、硫酸镁(AR)、矿物油，Sigma公司产品；引物、探针，Life Tec.公司产品。荧光PCR仪(ABI 7500)、PCR仪(ABI) ，Simpli Amp公司产品；水浴锅(HWS24)，上海一恒科学仪器有限公司公司产品；麦氏浊度仪，梅里埃Densicheck公司产品；紫外仪(WD-9403D)、电泳仪(DDY-2C)、电泳槽(DYCP-34)，北京市六一仪器厂。

1.1.3 沙门菌引物设计 参照文献[6]设计PCR引物；参照文献[7]设计荧光PCR引物和探针；参照文献[8]设计LAMP引物(表1)。

1.2 方法

1.2.1 细菌浓度标定和DNA提取 从平皿中挑取单个菌落，接种于3 mL的营养肉汤中，36℃培养过夜，8 000 r/min离心2 min，弃上清，沉淀用9 g/L生理盐水洗涤、离心1次，沉淀物用去离子水悬浮，用麦氏浊度法标定细菌浓度， 即1MCF≈3×108CFU/mL[9]。取菌液隔水煮沸15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清即为细菌DNA，冷冻备用。

表1 沙门菌引物序列信息

1.2.2 LAMP反应体系高温-低温前处理试验 设A和B 2个试验组，A组将未添加Bst酶的反应体系先95℃水浴1 min，移至50℃ 1 min,取出、开盖加入Bst酶并混匀，最后加入150 μL矿物油，密封管盖，63℃水浴1.5 h，直接目测观察结果。B组反应体系配制好后，直接63℃水浴1.5 h，目测观察结果。A、B 两个试验组同时检测沙门菌DNA各稀释度，比较两个试验组的灵敏度。

1.2.3 PCR、荧光定量PCR、电泳LAMP、可视LAMP方法灵敏度比较试验 PCR反应体系：PCR预混液12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，补ddH2O至25 μL。反应程序：94℃预变性3 min；94℃ 30 s,54℃ 30 s，72℃ 45 s,共30个循环；72℃再延伸10 min,4℃保存。直接取4 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，拍照分析结果。荧光定量PCR反应体系：荧光定量PCR预混液10 μL，上、下游引物各1 μL，探针1 μL，DNA模板2 μL，补ddH2O至20 μL。反应程序是：95℃预变性30 s；95℃ 5 s,60℃ 34 s,共40个循环；在延伸后期读取荧光信号。

LAMP反应体系为：10×Bst缓冲液2.5 μL，(8 U/μL)Bst1 μL，10 mmol/L dNTP 3.5 μL，100 mmol/L MgSO40.8 μL，5 mol/L Betaine 4 μL，20 μmol/L F3 0.1 μL，20 μmol/L B3 0.1 μL，20 μmol/L FIP 0.8 μL，20 μmol/L BIP 0.8 μL，总DNA 2 μL，加ddH2O至 25 μL，加入150 μL液体石腊。LAMP反应程序：反应体系(不含Bst酶)先95℃水浴1 min，移至50℃水浴1 min，取出、开盖加入Bst酶并混匀，最后加入150 μL液体石腊，密封管盖，63℃水浴1.5 h，再煮沸2 min终止反应，取4 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，拍照分析结果。

可视LAMP反应体系即是在LAMP反应体系基础上加入2 mmol/L羟基萘酚蓝(HNB)1.8 μL,反应体程序与LAMP相同，不进行产物电泳，直接目测观察结果。

上述4种方法检测沙门菌DNA各稀释度，根据结果比较各方法的灵敏度。

1.2.4 可视LAMP特异性试验 将伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等常见致病性沙门菌和其他18种肠道致病菌如大肠埃希菌、痢疾志贺菌等培养过夜，按1.2.1法将菌液稀释至1 MCF后，采用热裂解法提取细菌DNA。用可视LAMP反应体系和反应程序，检测各细菌DNA，检验可视LAMP特异性。

1.2.5 样品基质干扰试验 设置2种采样方式，取猴肛拭子、猴粪便2 g各1份置于10 mL增菌液中，36℃培养过夜，分别取上层增菌液3 mL备用。分别用增菌液按10倍递增法稀释6×108CFU/mL浓度的沙门菌，将各个稀释度的菌液离心，沉淀用去离子水洗涤1遍，最后用去离子水恢复至原体积，使沉淀完全悬浮。按1.2.1法热裂解细菌提取DNA。用可视LAMP检测所提取的DNA，比较样品基质对试验的干扰情况。

1.2.6 可视LAMP与分离鉴定法比较试验 在实验猴繁育场分别采用可视LAMP和细菌分离鉴定方法(国标方法)检测实验猴沙门菌[10]，统计两种方法的检验结果，比较二者的检出率和符合率。

2 结果

2.1 LAMP反应体系高温-低温前处理试验

反应体系经过高温-低温前处理的A组敏感性是6 CFU/反应，未经过高温-低温前处理的B组敏感性只有600 CFU/反应，A组敏感性显著高于B组(图1)，说明高温DNA变性和低温促使DNA与引物结合步骤可显著提高可视LAMP方法的敏感性。

2.2 敏感性试验结果

结果见图2。图2A显示,沙门菌invA基因的PCR扩增产物长度与目标基因331 bp相符，PCR扩增产物量随模板量降低而减少，最低检出限为60 CFU/反应。图2B显示沙门菌Ttr基因荧光定量PCR扩增曲线，最低检出限为6 CFU/反应。传统LAMP和可视LAMP都可以对沙门菌invA基因有效扩增，图2C 显示，LAMP扩增产物琼脂糖凝胶电泳条带呈典型的梯状排列，最低检出限为6 CFU/反应。图2D显示,可视LAMP，阴性管保持蓝紫色无变化，阳性管变成青蓝色，最低检出限为6CFU/反应，证明指示剂羟基萘酚蓝对LAMP反应无不良作用。 综合以上结果表明，可视LAMP与荧光定量PCR、传统LAMP检测敏感性相当，都是6 CFU/反应，高于PCR法敏感性60 CFU/反应，可视LAMP目测判定结果，简单明了，技术优势明显。

A.处理；B.未处理；1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.6×10-1;N.阴性对照

A.Pretreatment;B.Non-treatment；1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.6×10-1;N.Negative control

图1 LAMP反应体系高温-低温前处理试验结果

Fig.1 Visual LAMP test results of system pretreatment procedure by rising and dropping temperature

A.PCR；B.荧光定量PCR扩增曲线；C.LAMP;D.可视LAMP;1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.6×10-1;7.6×10-2;N.阴性对照

A.PCR；B.FQ-PCR；C.LAMP;D.Visual LAMP;1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100;6.6×10-1;7.6×10-2;N.Negative control

图2敏感性试验结果

Fig.2 Sensitivity test results

2.3 可视LAMP特异性试验结果

图3显示,同属的伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌呈阳性反应，其他常见肠道致病菌如大肠埃希菌、痢疾志贺菌等均呈阴性反应，表明该可视LAMP对沙门菌扩增有较强的特异性。

2.4 样品基质干扰试验结果

样品基质干扰试验结果显示(图4)，肛拭子组、猴粪便增菌培养物组可视LAMP敏感性均达到6 CFU/反应，不产生假阳性，表明肛拭子、猴粪便增菌培养物对可视LAMP的敏感度和特异性无明显影响。

1.伤寒沙门菌;2.甲型副伤寒沙门菌;3.乙型副伤寒沙门菌;4.鼠伤寒沙门菌;5.肠炎沙门菌;6.大肠埃希菌;7.痢疾志贺菌;8.小肠结肠炎耶尔森菌;9.空肠弯曲杆菌;10.溶血性链球菌;11.粪链球菌;12.李斯特菌;13.粪肠球菌;14.金黄色葡萄球菌;15.表皮葡萄球菌;16.铜绿假单胞菌;17.产气荚膜梭菌;18.阪崎肠杆菌;19.奇异变形杆菌;20.蜡样芽胞杆菌;21.绿脓杆菌;22.副溶血性弧菌;23.肺炎克雷伯菌;N.阴性对照

1.Salmonellatyphi;2.SalmonellaparatyphiA;3.SalmonellaparatyphiB;4.Salmonellatyphimurium;5.Salmonellaenteritis;6.Escherichiacoli;7.Shigelladysentery; 8.Yersiniaenterocolitca;9.Campylobacterjejuni;10.Streptococcushemolyticus;11.Streptococcusfaecalis;12.Listeria;13.Enterococcusfaecalis;14.Staphylococcusaureus;15.Staphylococcusepidermidis;16.Pseudomonasaeruginosa;17.Clostridiumperfringens;18.Enterobactersakazaki;19.Proteusmirabilis;20.Bacilluscereus;21.Pseudomonasaeruginosa;22.Vibrioparahaemolyticus;23.Klebsiellapneumoniae;N.Negative control

图3可视LAMP特异性试验结果

Fig.3 Specificity test result of visual LAMP

A.去离子；B.肛拭子；C.猴粪;1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.0.6×10-1;N.阴性对照

A.Deion; B.Anal swab; C.Monkey faeces;1.6×104;2.6×103;3.6×102;4.6×101;5.6×100; 6.0.6×10-1;N.Negative control

图4样品基质干扰试验结果

Fig.4 Sample disturbance test results of visual LAMP

2.5 可视LAMP与细菌分离鉴定法对比试验结果

应用可视LAMP和细菌分离鉴定法同时检验实验猴肛拭子21批次共3 050头份，结果分别检出28份和17份阳性样品，分离鉴定法17份阳性样品包含于在可视LAMP阳性样品中。表明可视LAMP检出率显著高于分离鉴定法。用实时荧光定量PCR检测前述全部阳性样品，结果均为阳性，表明可视LAMP检测结果准确性高。此外，相对于细菌分离鉴定法，可视LAMP法检验效率高，结果判定直观明了，可以大幅提高猴场沙门菌检疫技术水平。

3 讨论

本研究在环介导等温扩增反应体系中引入指示剂羟基萘酚蓝形成可视LAMP，比较试验表明，指示剂不影响LAMP体系的性能，可视LAMP和传统LAMP敏感性和特异无显著差异。可视LAMP的优点之一是目测反应管颜色变化判断结果，不需要电泳检测扩增产物。可视LAMP的优点之二是检测由始至终不打开反应管盖，避免气溶胶污染，克服传统LAMP开盖检测极易导致实验室污染的缺点。其三是增加反应体系高温模板变性和低温促进引物和模板结合前处理步骤，可显著提高反应灵敏度。据此建立的可视LAMP检测沙门菌方法的灵敏度与传统LAMP、荧光PCR相当，高于PCR 10倍。该方法对伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒、肠炎、鼠伤寒等致病性沙门菌检测均呈阳性，对其他肠道常见菌检测呈阴性。反映受肛拭子或粪便样品基质干扰不显著。对猴场实际样品检测结果表明，可视LAMP检出率显著高于细菌分离鉴定法，且检测效率远高于后者。可见，可视LAMP基于LAMP，继承了LAMP反应效率高、设备要求低的特点[11]，可视LAMP又高于传统LAMP，克服了传统LAMP易污染的同时操作进一步简化，特别适合基层或野外作业，是非常有推广应用价值的检测技术。