血府逐瘀汤对冠心病血瘀模型家兔氧化应激的影响

唐汉庆,庞路路,张世田,冯 悦,宁晚玲,王露瑶

(1.右江民族医学院，广西百色 533000；2.广西中医药大学，广西南宁 530001)

心血管功能异常使心血管疾病的发病率和死亡率上升，冠心病(coronary heart disease，CHD)由于冠状动脉循环异常引起心肌缺血、心功能受损，严重危害健康，研究显示[1],血管内皮功能紊乱是冠心病发生的重要因素和中心环节，也是CHD冠状动脉痉挛以及心绞痛发生的重要原因。由于高血压、CHD、炎症等引起的氧化应激损伤产生大量的活性氧(reactive oxy gen species,ROS)，引起心肌细胞、内皮细胞受损及功能障碍，促进CHD等发生发展。因此，减轻氧化应激损伤、改善微循环是早期防治CHD的关键。氧化应激伴有血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)激活，通过NADPH氧化酶2(NOX2)促进ROS和炎症介质大量产生，ROS和炎症介质的作用引起心肌细胞氧化损伤和内皮细胞功能异常以及血管改变。机体内部存在氧化和抗氧化机制，血府逐瘀汤活血化瘀功效确切，本试验通过建立冠心病家兔血瘀模型，给予血府逐瘀汤干预，检测与氧化、抗氧化密切相关的细胞分子水平及NOX2表达变化，从抗氧化角度探讨血府逐瘀汤对CHD的治疗作用环节。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康家兔48只，雌雄各半，体重2.8 kg±0.8 kg，右江民族医学院科学实验中心提供，动物合格证编号SCXK(桂)2014—0002，常规喂饲。

1.1.2 主要试剂和仪器 AngⅡ(批号20150223)、ROS(批号20150466)、丙二醛(malonaldehyde,MDA，批号20150822)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD，批号20150615)、谷胱甘肽(glutathione,GSH，批号20160624)、总抗氧化能力(total antioxidative capacity,T-AOC，批号20160610)、肌酸激酶(creatine kinase，CK，批号20150314)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH，批号20150611)试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品；NOX2免疫组化试剂盒(批号CQ14112B),美国Sigma公司产品；全自动生化仪(BS-400型)，深圳迈瑞公司产品产品；图像分析仪(Q550CWX型)，德国莱卡公司产品；酶标仪(MK3型)，美国Thermos Labsystem公司产品；小动物呼吸机(BiPAP Synchrony)，上海飞利浦公司产品；γ放射免疫计数器(FJ-2021型)，广州飞迪公司产品；倒置生物显微镜(DMIL LED型)，德国莱卡公司产品；电脑快速恒冷冷冻石蜡两用切片机(KD-2258-VI型)，浙江科迪公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物造模和分组 动物按随机数字表法分为对照组，模型组，假手术组，血府逐瘀汤低、中、高剂量6组，每组8只。模型组、低剂量、中剂量、高剂量组造模方法参照文献[2]，动物麻醉，辅助呼吸，左冠状动脉远端放置缩窄环，术后连续4 d常规消毒抗炎，制备冠心病心肌瘀血模型。假手术组开胸但不放置缩窄环。术后第12周起，低剂量、中剂量、高剂量组每天早上8：00以血府逐瘀汤按10、20、40 g/kg体重灌胃(intragastric administration，ig)，1次/d，连续治疗21 d。对照组、假手术组、模型组则灌胃等体积生理盐水。家兔给药剂量的计算依据，参照文献[3]中药复方药动学研究中给药剂量标准进行折算。

1.2.2 血府逐瘀汤制备 按2015版《中国药典》，血府逐瘀汤由桃仁70 g，红花、当归、柴胡各60 g，生地黄50 g，枳壳40 g，川芎、赤芍、桔梗、甘草各30 g，牛膝20 g组成。按照比例称取各药，本院药理教研室提供并鉴定。先给予药物清水漂洗2次，加双蒸水浸泡30 min后煎煮30 min，收集煎煮液，药渣再加水煎煮20 min，合并2次滤液，水浴加热浓缩至含生药2 g/mL灭菌，4℃保存备用。

1.2.3 AngⅡ、ROS、CK、LDH、T-AOC、SOD、GSH、MDA水平检测 取静脉血8 mL，加入冰浴的酶抑制剂30 μL和0. 3 mmol EDTA-Na2，4℃ 1 000 r/min离心5 min，分离血清，置-70℃冻存，采用放射免疫分析法在冰浴中测定AngⅡ；采用比色法测定血清ROS、T-AOC；全自动生化仪测定CK、LDH；黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性；二硫代二硝基苯甲酸法测定GSH；硫代巴比妥酸显色法测定MDA，均严格按照操作步骤进行检测。

1.2.4 NOX2表达检测 取心尖部位心肌组织，40 mg/mL多聚甲醛固定48 h，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋心肌组织切片，厚度3 μm～4 μm，60℃烘箱内烘烤1.5 h，二甲苯、乙醇脱蜡与水化，切片浸入pH6.0 PBS缓冲液中，微波加热进行抗原修复，30 mL/L甲醇-H2O2灭活内源性过氧化物酶，50 mg/mL BSA封闭液封闭20 min，滴加一抗，4℃孵育12 h，再滴加二抗，DAB显色，细胞核复染，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明，树胶封片,生物光学显微镜观察并拍片。

2 结果

2.1 各组AngⅡ、ROS、CK、LDH水平检测结果

与对照组比较，模型组AngⅡ、ROS、CK、LDH水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，低剂量组各指标改善不明显，中剂量、高剂量组AngⅡ、ROS、CK、LDH水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)(表1)。

2.2 各组T-AOC、SOD、GSH、MDA水平检测结果

与对照组比较，模型组T-AOC、SOD、GSH水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01)，而MDA水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，中剂量、高剂量组T-AOC、SOD、GSH水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)，而MDA水平显著下降(P<0.05)(表2)。

表1 各组AngⅡ、ROS、CK、LDH水平比较

注：与对照组比较，△P<0.05；△△P<0.01;与模型组比较，*P<0.05；**P<0.01。

Note：Compare with control group,△P<0.05；△△P<0.01;Compare with model group, *P<0.05；**P<0.01.

表2 各组T-AOC、SOD、GSH、MDA水平比较

注：与对照组比较，△P<0.05；△△P<0.01;与模型组比较，*P<0.05；**P<0.01。

Note：Compare with control group,△P<0.05；△△P<0.01;Compare with model group, *P<0.05；**P<0.01.

2.3 NOX2表达检测

如图1，棕褐色细胞为阳性表达细胞。对照组棕褐色细胞密度很小；假手术组棕褐色细胞也较少，密度和对照组相似；模型组棕褐色细胞明显增多，密度增大；低剂量组棕褐色细胞较多，减少不明显；中剂量组和高剂量组棕褐色细胞减少，密度降低，以高剂量组明显。

3 讨论

冠心病的特征病理变化为心肌细胞完整性损害、血管内皮细胞功能破坏、成纤维细胞异常增生。冠心病心血管损伤与氧化应激反应的研究显示，心肌缺血时，由于代谢产物、病理产物的蓄积，氧化应激反应产物超出了抗氧化反应清除机制的能力，引起氧化应激反应产物聚集在心肌细胞，使心脏泵功能减退[4]。在心肌瘀血中，氧化应激及其介导的血管内皮细胞氧化损伤反应在冠心病的发生发展、病理转归与预后中发挥重要作用[5]。氧化应激反应激活AngⅡ，促使其表达增加，AngⅡ一方面通过Ras-Raf-ERK途径介导强缩血管物质的产生，进而通过上调 NOX亚型特别是NOX2的表达从而启动了氧化损伤反应，包括对心肌细胞和血管内皮细胞功能的严重损害[6]。其中，心肌细胞完整性受到损害后，CK和LDH释出，血清水平显著提高，其水平高低反映了心肌细胞受损程度，是临床诊断心肌梗死的重要参考指标。本试验结果表明，模型组AngⅡ、ROS、CK、LDH、NOX2表达水平均比对照组升高或显著升高，提示心肌细胞受到氧化损伤。另一方面，AngⅡ直接作用于NOX2，激活NOX2诱导产生大量ROS，使血管舒张因子失活，抑制了其对血管内皮细胞保护作用，并阻碍了炎症反应的缓解作用[7-8]，同时，ROS还通过抑制心肌K+的去极化作用于 L型慢Ca2+通路，产生负性肌力作用，并进一步通过其促心肌细胞凋亡与内皮细胞的损伤作用使心脏受损[9-10]。因此，对于CHD的治疗，早期扭转氧化应激对心肌细胞和血管内皮细胞功能的损伤是防止CHD发展并防止心功能恶化的重要策略。

A.对照组；B.模型组；C.假手术组；D.低剂量组；E.中剂量组；F.高剂量组

A.Control group；B.Model group；C.Sham group；D.Low-dose group；E.Middle-dose group；F.High-dose group

图1 NOX2表达(IHC,200×)

Fig.1 Expression of NOX2 (IHC,200×)

机体存在抗氧化损伤的机制，T-AOC、SOD、GSH水平反映了机体清除自由基的抗氧化能力；MDA是氧化产物，间接反映自由基水平，通过检测上述指标，可推知机体氧化和抗氧化能力的状况。本试验表明，模型组T-AOC、SOD、GSH水平下降或显著下降，而MDA水平升高，提示心肌缺血，机体抗氧化能力的下降。

血府逐瘀汤具有改善血液循环、血管内皮细胞功能等效果，可用于治疗CHD等[11-12]，采用血府逐瘀汤干预后，反映氧化损伤程度的AngⅡ、ROS、CK、LDH、NOX2水平均趋向于对照组水平；同时，反映机体抗氧化能力的T-AOC、SOD、GSH水平也趋于正常，表明血府逐瘀汤具有减轻氧化损伤的作用。本试验也提示，从剂量看，低剂量对各指标改善效果不明显，整体上以中剂量和高剂量作用效果较好，推测其原因，可能低剂量需要更长的给药时间才能显示其效果，而本试验给药时间只有3周，因此，提示临床应用血府逐瘀汤，需要考虑其用量，同时也不要忽略其治疗用药时间。综上所述，本试验提示，血府逐瘀汤治疗CHD的机制与其抗氧化损伤作用有关，相关的机制值得进一步深入研究，为认识血府逐瘀汤及拓宽其应用提供进一步的实验资料。