大鼠骨骼肌挫伤后bFGF与c-Fos阳性细胞率比值与损伤时间关系的研究

李林峰，曾 达，林 伟，李雪榕，柳丹凤，田 甜，刘 敏Δ

1.四川大学 华西基础医学与法医学院(成都 610041)；2.广东南天司法鉴定所(深圳 518045)

在法医学实践中，骨骼肌损伤是机械性暴力最易造成的病理改变之一，其损伤时间常直接关系到案件的侦查方向及性质。目前在法医学实际检案过程中，要相对准确地推断骨骼肌损伤时间较困难，骨骼肌损伤时间的推断一直是法医学的研究热点。董塔娜等[1]研究发现，Fzd2 mRNA表达量在骨骼肌损伤后会随着损伤时间的延长呈现一定的时序性变化规律。程子惠等[2]研究表明，骨骼肌损伤后p-CB1R的表达也存在一定的时序性。之前的研究多为对单一生化指标进行测定[1-3]，尽管各种生化指标的变化存在一定的时序性，但同一个测定值往往对应多个时间点，故难以推断骨骼肌损伤的时间范围。

金伟等[4]研究表明，脑震荡伤后通过测定伤后不同时间内组织细胞中热休克蛋白70和c-Fos表达情况，观察不同损伤时间二者表达比值的变化，并与二者变化情况相结合，能够用于推断脑震荡的损伤时间。而根据两种不同生化指标表达比值的改变来推断骨骼肌损伤时间尚未见研究报道。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一种具备多种效能的细胞生长因子[5]，可促进新的血管形成和创伤组织内的细胞增殖进而加速创伤的愈合[6-7]。当骨骼肌受到外界暴力打击时，c-Fos基因作为一种重要的即刻早期基因，迅速被诱导激活并表达，而其表达的蛋白能够保护损伤的肌肉细胞，减轻损伤对肌细胞的影响[8]。本实验通过研究大鼠挫伤肌细胞中bFGF与c-Fos的表达情况，分析二者变化情况同骨骼肌损伤时间的关系，并结合二者比值变化情况，以期推断骨骼肌损伤时间。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及模型制作

健康成年SD大鼠65只，雌雄不限，体重180～200 g，购于四川大学实验动物中心。依据处死时间的不同，随机分为12个实验组和1个对照组，每组5只。参照Marmarou等[9]实验方法制作实验组大鼠骨骼肌挫伤模型：将大鼠俯卧位固定于鼠板上，用海绵垫将备皮后的左后肢稍外旋垫起，使小腿后肌群置于胫腓骨内侧，用500 g砝码从70 cm高度自由下落导致左小腿骨骼肌挫伤，而打击处皮肤仍保持完整，胫腓骨无骨折。实验组大鼠于骨骼肌挫伤后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、7 d、10 d和14 d采用颈椎脱臼法处死。对照组大鼠适应性喂养24 h后采用颈椎脱臼法处死。分别取实验组大鼠挫伤处骨骼肌及对照组大鼠正常骨骼肌，并立即将所取肌肉样品置于固定液中固定，之后行石蜡包埋、切片。

1.2 染色方法

常规进行HE染色。免疫组化染色(SABC方法)如下：采用微波加热对抗原进行修复后，滴入BSA封闭液封闭非特异性抗原，装入保湿盒内在37 ℃下放置0.5 h后,在实验组切片上滴加兔抗大鼠c-Fos及bFGF多克隆抗体作为一抗, 阴性对照组切片滴加PBS来替代一抗，滴加一抗后将切片放入4 ℃冰箱过夜。从4 ℃冰箱取出的切片经37 ℃复温及PBS冲洗后，滴加生物素化的山羊抗兔IgG抗体作为二抗，37 ℃孵育45 min后滴加链霉素亲和素生物素复合物，再次置于37 ℃下0.5 h；切片取出后依次加入显色液及复染液，待良好显色后常规进行脱水、透明、封片。

1.3 染色结果分析

bFGF及c-Fos阳性表达判定标准为细胞胞浆内出现均匀分布的棕黄色细小颗粒，而阴性对照组细胞胞浆内无棕黄色细小颗粒。实验组及对照组切片均在显微镜高倍镜(×400)下随机选取5个视野拍照储存，对收集到的切片图像进行分析，计算阳性细胞率(阳性细胞率=阳性细胞数目/总细胞数目)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 骨骼肌挫伤后病理学变化规律

实验组大鼠经打击后，挫伤局部皮肤完整，皮下出血、肿胀，镜下见骨骼肌局部出血、水肿。伤后6 h镜下见部分骨骼肌间质水肿出血，肌细胞胞浆均质化，横纹不清。伤后12 h～1 d，挫伤局部皮下出血缓解，镜下见挫伤处骨骼肌间质较多的炎细胞浸润，肌细胞胞浆明显均质化，横纹消失。伤后3 d镜下见新生骨骼肌出现，间质出血及水肿减轻。伤后7 ～14 d，挫伤局部已无明显出血及水肿现象，镜下见新形成的肌细胞明显增多，炎细胞基本消失。伤后14 d可观察到新生骨骼肌与周边肌纤维融合。

2.2 免疫组织化学染色结果

2.2.1 bFGF表达情况 对照组大鼠相应部位骨骼肌细胞未见bFGF阳性表达。实验组大鼠骨骼肌细胞在伤后6 h时见bFGF阳性表达，并逐渐升高，于伤后7 d阳性细胞率达到峰值，之后阳性表达逐渐减弱。伤后14 d，仍然可见bFGF阳性表达的骨骼肌细胞(图1)。bFGF阳性反应主要位于骨骼肌细胞胞浆外周和肌膜。

图1 骨骼肌挫伤后bFGF免疫组化染色结果(SABC×400)

2.2.2 c-Fos表达情况 对照组大鼠相应部位骨骼肌细胞未见c-Fos阳性表达。实验组大鼠骨骼肌细胞在伤后0.5 h可见c-Fos阳性表达。随着损伤时间的延长，骨骼肌细胞中c-Fos表达逐渐增强，c-Fos阳性细胞率逐渐升高，挫伤后3 h时达到峰值，之后呈下降趋势。挫伤后14 d，大鼠骨骼肌细胞内c-Fos阳性表达消失(图2)。c-Fos阳性反应主要位于骨骼肌细胞胞浆内。

图2 骨骼肌挫伤后c-Fos免疫组化染色结果(SABC×400)

2.3 bFGF与c-Fos阳性细胞率比值的变化

实验组阳性细胞率与对照组比较，差异有统计学意义。bFGF与c-Fos阳性细胞率的比值呈现单调递增的趋势，骨骼肌挫伤后0.5～3 h，c-Fos阳性细胞率升高，但bFGF尚未出现阳性表达，二者阳性细胞率的比值为0；伤后3 h～1 d二者均存在阳性表达，但bFGF阳性细胞率低于c-Fos阳性细胞率，二者阳性细胞率比值在0～1.22。伤后1～14 d，bFGF阳性细胞率开始高于c-Fos，且差值逐渐加大，二者阳性细胞率比值>1.22并持续上升(表1)。

3 讨论

3.1 bFGF阳性表达与骨骼肌损伤时间的关系

bFGF在正常骨骼肌细胞内不表达或仅微弱表达，而当骨骼肌受到损伤后其表达增加并发挥生物学功能。刘秀娟[10]研究发现骨骼肌在过度运动造成损伤后，bFGF mRNA表达明显增强；研究[11]同样表明骨骼肌在较大强度锻炼后bFGF mRNA表达水平显著升高；徐明明等[12]研究发现骨骼肌挫伤后，bFGF平均光密度值变化存在一定时序性。但目前尚未见将bFGF作为一种生化指标用以判断骨骼肌损伤时间的研究报道。本研究发现bFGF在骨骼肌挫伤后0～3 h未见表达，伤后6 h出现阳性表达信号，伤后7 d达到峰值，7 d后bFGF表达水平逐渐下降。本研究发现骨骼肌挫伤后bFGF表达变化存在随损伤时间变化的规律性，但单独凭借其变化规律无法推断骨骼肌损伤的时间范围。

表1 bFGF、c-Fos阳性细胞率及二者比值的变化

注：①表示同对照组比较，差异具有统计学意义；②表示同相邻上一组比较，差异具有统计学意义

3.2 c-Fos阳性表达与骨骼肌损伤时间的关系

c-Fos基因的蛋白产物可参与机体应激反应，在损伤后对机体具有保护作用[13]。闫红涛等[3]研究发现骨骼肌损伤后15 min即可检见c-Fos蛋白阳性信号，1 h达到高峰，之后呈下降趋势，1 d后恢复正常。本研究结果提示骨骼肌挫伤后0.5 h出现c-Fos阳性表达，表达信号逐渐增强，于3 h时达到最高点，之后其表达逐渐减弱，伤后14 d时，c-Fos阳性表达信号已消失。本研究结果的表达变化趋势与之前学者的研究结果相似[3]。本研究发现c-Fos表达变化同样存在时序性规律，但仅凭借该变化规律同样无法推断骨骼肌损伤的时间范围。

3.3 bFGF、c-Fos阳性细胞率比值与骨骼肌损伤时间的关系

本研究结果显示当bFGF和c-Fos的阳性细胞率比值为0，c-Fos阳性细胞率升高但bFGF未见阳性表达时，可推测骨骼肌损伤的时间在0.5 ～3 h；当bFGF和c-Fos的阳性细胞率比值>0但<1.22时，二者均出现阳性表达，但c-Fos阳性细胞率高于bFGF，此时可以推测骨骼肌损伤时间在3 h～1 d；当bFGF和c-Fos的阳性细胞率比值>1.22时，二者阳性细胞率均呈下降趋势，且bFGF阳性细胞率始终高于c-Fos，故此时难以推测骨骼肌损伤的时间范围。

综上所述，本研究表明采用两种表达时间存在先后差异的生化指标，通过二者阳性细胞率比值的时序性改变并结合二者各自阳性细胞率的变化情况，可推断骨骼肌挫伤的损伤时间。