大鼠少突胶质细胞体外培养方法

孟赞 唐栎

摘 要： 目的：体外培养高纯度的少突胶质细胞。方法：取SD乳鼠脑皮质，用增殖培养基联合EDTA消化机械吹打分离纯化法培养纯化；光学显微镜观察细胞形态；纯化培养3d后免疫荧光染色鉴定细胞类型。结果：获得高纯度的少突胶质前体细胞以及成熟的少突胶质细胞，少突胶质前体细胞免疫荧光A2B5标记阳性，成熟少突胶质细胞免疫荧光MBP标记阳性。结论：用增殖培养基联合EDTA消化机械吹打分离纯化法可以得到高纯度的少突胶质前体细胞以及成熟少突胶质细胞。

关键词： 少突胶质细胞；原代培养；细胞增殖；EDTA

少突胶质细胞（oligodendrocytes， OLs）是中枢神经系统中胶质细胞的[1]。少突胶质细胞由少突胶质前体细胞 （oligodendrocyte progenitor cells， OPCs）分化成熟而来，少突胶质细胞生长发育的损伤可致脱髓鞘疾病导致神经系统损伤[2]，因此研究少突胶质细胞的损伤机制，促进少突胶质细胞修复是我们的目标。所以得一种简单高效的培养少突胶质细胞的方法具有重要的意义。本实验在传统的培养方法的基础上，对细胞增殖和分离纯化等相应步骤进行了适当改进，简化了实验操作步骤，节约了实验成本，成功获取了大量的少突胶质细胞，为研究少突胶质细胞的损伤的其分子机制奠定基础。

材料和方法

1 材料 清洁级出生0～3d SD乳鼠，雌雄不限，动物饲养环境为清洁级，实验过程对动物的处置符合相关动物伦理学要求，B104神经母细胞瘤细胞株，DMEM/F12，胎牛血清，胰酶，多聚赖氨酸（PDL），小 鼠 抗 A2B5 抗体，羊抗小鼠髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）等。

2 方法

2.1 B104CM的收集和存储 B104细胞在20ml （DMEM/F12+10%FBS）培养基，75cm2的培养瓶 中常规培养，细胞80%～90%融合时，弃去废液，加入10 ml（DMEM/F12 + 1% N2 supplement） 培养液，4d后收集上清液备用。

2.2 少突胶质细胞原代培养及分离纯化 取SD乳鼠，冰埋麻醉1～5 min，体积分数75%乙醇消毒，无菌下取出大脑皮质，解剖显微镜下剥离脑膜，取脑皮质切成1mm2小块，放入离心管中，加入PBS后用吸管轻轻反复吹打制成细胞悬液，种植于直径10cm由PDL包被的培养皿内（每只乳鼠的细胞接种于一个培养皿内）入孵箱常规培养5d，培养液为（DMEM/F12+10% FBS），隔天换液。培养5天后，B104CM（DMEM/F12+20%B104CM+1%N2 supplement）增殖3d后， EDTA消化机械吹打分离纯化法（EDTA消化10 min，适当力度吹打，使 OPC从星型胶质细胞上脱落） 分离和纯化 OPC。

2.3微镜观察 倒置显微镜观察细胞形态并采图。

2.4细胞免疫荧光染色OPC以3 ×107 /ml 的密度种植在两个24孔板中（每孔底部放置孔径相同的载玻片）分别培养1d和分化培养3d，PBS清洗，含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PBS）固定30min，山羊血清37℃封闭30min，加一抗，OPC加小鼠抗A2B5IgG （ 1：100） 标记，分化培养的少突胶质细胞加羊抗MBP IgG （ 1：100） 标记，4℃过夜，加抗羊IgG（ 1：500） ，湿盒内37℃孵育30 min，PI （ 1：1000） 染核30s，50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下采集图片。A2B5 标记阳性的为OPC，MBP标记阳性的为成熟的少突胶质细胞。

结 果

1 神经胶质细胞生长情况

混合培养5d，可见两种形态不同的细胞。多数细胞体积较大，紧贴瓶底生长，呈扁平状有较粗大突起，胞核较大，呈圆形。位于扁平细胞的表面可见一些体积小，胞体呈圓形或椭圆形，强折光性强，具有单极或双极的细小突起的细胞。培养第8d，在倒置显微镜下观察，胞体扁平、突起粗大的细胞已长满瓶底，细胞完全融合，小圆形或椭圆形、强折光性强，具 有单极或双极的细胞位于上层。纯化后培养1d的OPC胞体成椭圆型，折光性强，有单极或双极的细小突起。分化培养的细胞（第12 d）胞体逐渐由椭圆形变为圆形或不规则形， 细胞突起增多，培养至第14 d，次极细胞突起分支增 多，常交互形成“蜘蛛网”样，极为茂 密，分化为成熟的少突胶质细胞。

2 少突胶质细胞免疫荧光鉴定和观察

OPC特异性抗原A2B5阳性细胞占细胞总数95%以上，绿色荧光染色信号位于细胞膜OL特异性抗原MBP阳性，细胞占细胞总数95%以上，绿色荧光染色信号位于胞膜； OPC胞体呈椭圆形，具有典型的双极细小突起，绿色荧光标记的特异性抗原A2B5位于胞体和突起上。OL胞体为圆形，细胞突起多，次极细胞突起交互成网样，绿色荧光染色信号位于胞体和突起上。

原代培养神经细胞作为一种相对简化的模型， 生长发育特征与体内相似，且样本纯度高，实验条件比较恒定且可控，在阐明许多少突胶质细胞退化所致神经退行性疾病的细胞及分子机制方面有着不可替代的作用。本实验节约实验成本，简化培养步骤，获得了大量的少突胶质细胞，这对于以原代培养少突胶质细胞作为实验对象的研究而言尤为重要。A2B5是少突胶质前体细胞特异性标记物， MBP 是成熟少突胶质细胞特异性标记物，本实验利用上述两个蛋白与细胞核共同染色，对培养的细胞性质做鉴定及细胞纯度进行分析，证明细胞培养成 功，细胞纯度可以达到 95%以上。

参考文献

[1]龙彩瑕，李俊发.中枢神经系统退行性疾病研究概述[J].基础医学与临床，2005，25： 673-678.

[2]Tang Y，Nyengaard JR，Pakkenberg B，et al. Age-induced white matter changes in the human brain： a stereological investigation[J].Neurobiol Aging，1997，18： 609-615.