爱罗咳喘宁对COPD大鼠细胞因子（IL-4、IL-12、INF-γ）的影响※

王 祎 陈婷婷 倪 普 朱一鸣 黄 华 冯宜飞 冯奕鹏 尚立芝张红瑞

（河南中医药大学基础医学院，河南 郑州 450046）

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种可以预防和治疗的常见疾病，其特征是持续存在的、并呈进行性发展气流受限[1]。COPD的发病机制尚未完全明了，目前普遍认为COPD是以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征，由多种炎症细胞及炎症介质参与且相互作用所致，中性粒细胞活化、聚集、释放弹性蛋白酶等多种生物活性物质引起慢性黏液高分泌状态并破坏肺实质。COPD的主要临床表现为慢性咳嗽，咳痰，呼吸困难，常出现急性加重，多属于中医学“肺胀”“喘病”等范畴[2]。中医认为，COPD多表现为肺、脾、肾三脏的虚损，而痰浊和瘀血在其发病过程中扮演了病理产物和致病因素双重角色，互结为病，恶性循环，迁延难愈[3]。故而COPD的基本治法为化痰祛瘀，调畅气机。爱罗咳喘宁中药方剂有理气化痰，止咳平喘，健脾固肾之效，经多年临床和前期动物实验研究结果显示，爱罗咳喘宁口服液能显著提高COPD患者和动物模型的肺功能，改善肺组织结构，但其作用机制不明[4]。白细胞介素4（IL-4）是由活化的Th2（Th2型反应，即体液免疫）细胞产生的一种细胞因子，而白细胞介素12（IL-12）是由活化的Th1（Th1型反应，即细胞免疫）细胞产生的细胞因子[5]。在COPD患者体内，Th2淋巴细胞产生的细胞因子降低，而Th1淋巴细胞产生的细胞因子升高[6-7]。同时，有研究显示肺组织炎症反应越严重，血清IFN-gamma、IL-12、Th1/Th2， 及肺组织中IFN-gamma的 mRNA与STAT4蛋白水平越高，而肺功能及血清IL-4、IL-13及肺组织中IL-4 mRNA水平越低[8]。因此，白细胞介素4（IL-4） 和白细胞介素12（IL-12）的分子学检验对于分析COPD患者的病程与转归有重要意义。干扰素-γ（INF-γ）是一种多功能的细胞因子，临床研究表明，INF-γ具有抑制肿瘤生成、抗病毒、调节机体免疫力等作用[9]。处于急性加重期的COPD患者易在活化巨噬细胞作用下加快白细胞介素-12(IL-12） 的释放速度，增加血液内IL-12浓度，进一步刺激巨噬细胞及T细胞，提高血液内INF-γ水平，加重肺部组织损伤严重，影响患者预后质量[10]。INF-γ直接参与COPD的发病过程，与患者病情发展程度呈正相关性，临床应用价值较高[11-12]。本研究通过观察爱罗咳喘宁对COPD大鼠支气管肺泡灌洗液及肺组织匀浆中参与炎症反应的白细胞介素-4（IL-4），白细胞介素-12（IL-12），干扰素-γ（INF-γ） 的影响，以期研究爱罗咳喘宁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 7～8周龄SPF级wistar雄性大鼠60只，体质量（250±20） g。由河南省实验动物中心提供，合格证号SYXY（豫） 2010-0001。

1.1.2 药物 陈皮10 g(批号1502001H），茯苓15 g(批号1509001H），姜半夏10 g(批号1503001s），甘草6 g(批号1502001S）均选三九医药生产的中药配方颗粒，红旗渠香烟 (河南安阳厂，烤烟型，尼古丁含量1.1 mg/支，焦油含量14 mg/支），急支糖浆（太极集团重庆涪陵制药厂有限公司，规格100 mL/瓶，批号15090660）。

1.1.3 试剂与仪器 大鼠IL-4酶联免疫检测试剂盒 (杭州联科生物有限公司，批号230440715）、IL-12（北京诚林生物科技有限公司，批号201504）、INF-γ(上海邦奕公司，DRE20041）ELISA检测试剂盒。红旗渠牌香烟（河南安阳卷烟厂，烤烟型，尼古丁含量1.1 mg/支，焦油含量14 mg/支），脂多糖 (LPS，北京索莱宝科技有限公司，批号701C036）。小动物肺功能测量系统（德国leica公司）。BS210生物显微镜（麦克奥迪厦门销售有限公司），BSA124S-CW型万分之一天平 (德国赛多利斯），半自动轮转式切片机 (德国leica公司，RM2245），DB-B1型烤片机 (上海双旭电子有限公司），XH-C旋涡混合器 (常州金坛精达仪器有限公司），B11-3型磁力搅拌器 (上海司尔仪器有限公司），DHP-9050B智能型电热恒温培养箱（上海浪轩实验设备有限公司），ZWY-240型恒温摇床 (上海智诚），BCD-206YH型海尔冰箱(青岛海尔股份有限公司）等由河南中医学院科研试验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将60只大鼠随机分为6组：正常对照组，模型组，爱罗咳喘宁低、中、高剂量组和急支糖浆组，每组10只。

1.2.2 模型制备 采用香烟烟熏4周加气管内滴注脂多糖（LPS）2次的复合因素复制COPD稳定期肺气虚证大鼠模型。实验第1、14日，麻醉，暴露气管，1 mL注射器预装200μL的LPS注入气管内，立即竖起大鼠旋转，以防窒息并使LPS均匀分布于两肺。实验第2～13日、15～28日将大鼠置于密闭烟室（侧面开直径0.5 cm2通气孔），50 mL针筒抽取红旗渠香烟烟雾注入密闭熏烟箱内，保持烟雾浓度为5%，每日0.5 h。正常对照组不予烟熏，但采用LPS注入相同的方法气管内注入等量的生理盐水代替LPS。

1.2.3 给药方案 爱罗咳喘宁组中剂量组按正常剂量生药量4.9 g/kg（稀释成6 mL）灌胃，高剂量组按9.8 g/kg（稀释成6 mL）灌胃，低剂量组2.45 g/kg（稀释成6 mL）灌胃，每天2次，10AM与4PM各给药1次。急支糖浆组给予急支糖浆口服液每天3 mL（稀释成6 mL），分2次灌胃（按中剂量组成人用量7倍折算）；空白对照组及模型组给予同等剂量（6 mL）的生理盐水灌胃。以上各组连续灌胃14 d。

1.2.4 检测指标 （1）大鼠的一般状态：包括皮毛、体重、饮食情况、活动度、死亡情况；（2） 肺功能测定：潮气量（Tidal volume，TV）、呼气峰流速（Peak expiratory flow，PEF） 和50%潮气量呼气流量（Expiratory flow at 50%of lung volume，EF50）； （3） 血常规检查；（4）ELISA检测支气管肺泡灌洗液及肺匀浆中INF-γ、IL-4、IL-12的含量；（5） 病理切片观察 （固定，脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。连续冠状切片，HE染色，光镜下观察病理变化）；（6）免疫组化检测肺组织中INF-γ的表达（①切片脱蜡至水；②过氧化物酶阻断；③抗原热修复；④滴加封闭液；⑤滴加一抗，4℃过夜；⑥滴加山羊抗兔IgG；⑧滴加试剂SABC；⑨DAB显色，苏木素复染）。

1.2.5 统计学方法 数据处理采用SPSS 13.0统计学软件统计分析，定量资料采用均数±标准差（x±s）描述，组间比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验，相关性检验用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 爱罗咳喘宁对大鼠一般状况的影响 正常组大鼠无死亡，精神状况佳，活动灵敏，毛色乳白有光泽，大、小便无异常。造模初期，第1～14天时，造模的大鼠出现不同程度的抵抗及烦躁，第15天后神情倦怠，体型消瘦，毛色略黄无光泽，体重下降，饮食量及饮水量减少，大便稀而致垫料潮湿，可闻及呼吸音增粗、呼吸频率增快、咳嗽、气喘、鼻部可见浅黄色分泌物等。灌胃后，治疗组的以上症状呈不同程度的改善，其中爱罗咳喘宁中剂量组的症状改善最为明显。其他各组均死亡2只大鼠。

2.2 各组肺功能比较 与正常组比较，模型组大鼠用力肺活量（Forced vital capacity，FVC）、1秒钟用力呼吸容积（Forced expiratory volume in one second，FEV1），以及FEV1/FVC均显著变小（P<0.05）；与模型组比较，爱罗咳喘宁高、中剂量组FVC、FEV1，FEV1/FVC均不同程度增大（P<0.05），见表1。

表1 爱罗咳喘宁对各组大鼠肺功能的影响 （x±s）

2.3 爱罗咳喘宁对肺匀浆中INF-γ、IL-4和IL-12含量的影响 模型组肺匀浆中INF-γ、IL-4和IL-12含量均显著高于正常组（P<0.01，P<0.05）。

与模型组比较爱罗咳喘宁中、高剂量组中INF-γ、IL-4和IL-12均显著减少 （P<0.01，P<0.05）。

免疫组化检测肺组织中INF-γ表达，模型组INF-γ表达显著强于正常组。爱罗咳喘宁中、高剂量组中INF-γ表达较模型组减弱。见表2。

表2 爱罗咳喘宁对肺匀浆中INF-γ，IL-4和IL-12含量及INF-γ表达的影响 （x±s）

2.4 爱罗咳喘宁对肺组织结构的影响 正常组肺组织结构完整，肺泡腔内无渗出物。模型组肺内细支气管内有痰，肺泡上皮细胞不同程度的损伤，肺泡中有渗出液及炎细胞，肺泡间质炎细胞浸润明显，局部有肺大泡（肺气肿形成）。爱罗咳喘宁中、高剂量组和急支糖浆组炎症明显减轻。见图1。

2.5 免疫组化检测肺组织中INF-γ的表达 与正常组比较，模型组INF-γ表达明显增强，INF-γ阳性表达信号定位于肺泡上皮细胞胞浆和巨噬细胞胞浆。与模型组比较，爱罗咳喘宁中、高剂量组INF-γ表达显著增强。各组表达强度见表2，图2。

图1 各组肺组织结构改变（HE，×200）

3 讨论

本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠FVC、FEV1，以及FEV1/FVC均显著变小；与模型组比较，爱罗咳喘宁高、中剂量组FVC、FEV1，FEV1/FVC均不同程度增大，提示爱罗咳喘宁能改善COPD大鼠肺功能。基于此，该研究考虑可以用炎症细胞因子及其受体蛋白等生物指标来反映COPD患者的临床肺功能。血清IL-6、TNF-α、INF-γ等炎症介质的表达水平均同COPD合并肺部感染呈显著相关性，临床可将其作为评估患者病情发展、预测其预后质量的重要依据，全面提升诊疗针对性及有效性。模型组肺匀浆中INF-γ、IL-4和IL-12含量均显著高于正常组。通过各组对肺匀浆中INF-γ、IL-4和IL-12含量的比较，与模型组比较，爱罗咳喘宁中、高剂量组中INF-γ、IL-4和IL-12均显著减少。免疫组化检测肺组织中INF-γ表达，模型组INF-γ表达显著强于正常组。爱罗咳喘宁中、高剂量组中INF-γ表达较模型组减弱。肺组织结构光镜下显示，正常组肺组织结构完整，肺泡腔内无渗出物。模型组肺内细支气管内有痰，肺泡上皮细胞不同程度的损伤，肺泡中有渗出液及炎细胞，肺泡间质炎细胞浸润明显，局部有肺大泡（肺气肿形成）。爱罗咳喘宁中、高剂量组和急支糖浆组炎症明显减轻。免疫组化检测肺组织中INF-γ的表达，与正常组比较，模型组INF-γ表达明显增强，INF-γ阳性表达信号定位于肺泡上皮细胞胞浆和巨噬细胞胞浆。与模型组比较，爱罗咳喘宁中、高剂量组INF-γ表达显著减弱，提示爱罗咳喘宁可能通过抑制INF-γ的表达而对抗炎症反应。

综上所述，与正常组相比，模型组中INF-γ，IL-4和IL-12含量高于正常组，提示INF-γ，IL-4和IL-12均参与COPD病理过程。爱罗咳喘宁对COPD干预有效，其机制可能通过抑制INF-γ，IL-4和IL-12的合成与分泌而阻滞COPD炎症过程。其详细机制有待深入研究。