玉竹多倍体的育种研究

李国泰，李学丽

(通化师范学院生命科学学院，吉林 通化 134002)

玉竹[Polygonatumodoratum(Mill.)Druce]，为百合科黄精属多年生草本植物[1]，原产中国西南地区，但野生分布很广。耐寒，亦耐阴，喜潮湿环境，适宜生长于排水条件较好，土壤肥沃疏松以及土层深厚地区[2]。植物的根茎具有很重要的药用价值，用秋水仙素诱导其染色体数目加倍，并采用常规的染色体压片方法[3]对玉染色体进行核型分析，得到人工培育和鉴定玉竹多倍体的方法。加速优质玉竹的育种进程，为药物研发提供新材料；也可以为人工诱发植物多倍体提供理论依据；还可以为玉竹的育种、开发及利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料玉竹采集于通化师范学院后山。

1.2 实验过程与方法

1.2.1 玉竹根尖的预处理[4]

(1)脱脂棉包裹法：将玉竹幼苗根部清洗干净， 用浸透0.1%秋水仙素溶液的脱脂棉包裹玉竹幼苗根部，并用塑料袋包裹防止水分蒸发。

(2)浸渍法：将玉竹幼苗根部清洗干净，放入装有0.1%秋水仙素溶液的锥形瓶中，并在瓶口塞脱脂棉防止秋水仙素蒸发。

(3)正常培养：将玉竹幼苗栽于花盆中培养。

定期为玉竹幼苗补充秋水仙素及水分，观察其生长情况，并检查其根尖变化情况。

1.2.2 玉竹根尖的固定。培养2周之后，待幼苗嫩根膨大，长到1～2cm时，即可对根尖进行固定。

固定：于9:30～11:30细胞分裂旺盛时[5]，分别取出经过上述3种预处理的玉竹幼苗，剪取嫩根尖1cm长，将根尖分别放在3个装有蒸馏水的培养皿中水洗3次，每次水洗3min，配制卡诺固定液[6]，即无水乙醇(95%乙醇)∶冰乙酸=3∶1的比例均匀混合倒入广口瓶中，在4℃下，将水洗过的根尖放入卡诺固定液中进行固定，固定24h。

1.2.3 玉竹根尖的保存。将固定后的根尖取出并水洗，放入60%的乙醇水溶液中保存。

1.2.4 解离

(1)配制解离液，浓盐酸∶无水乙醇=1∶1，即无水乙醇与等量的浓盐酸混合配成解离液。

(2)取3个小烧杯，分别倒入多半杯解离液,置于 61～62℃的恒温水浴锅中, 当烧杯中解离液的温度恒定在 60℃时, 将备用的嫩根尖用镊子放入其中(1～2个), 60℃恒温处理 12～21min,解离时间结束后，迅速取出小烧杯，用镊子将根尖转移到装有蒸馏水的培养皿中水洗4次, 每次2min，彻底洗去盐酸，解离过程就完成了。

1.2.5 染色及压片。取一张干净的磨砂载玻片，用镊子夹取解离后的玉竹根尖置于载玻片中央，用吸水纸吸取根尖上残留的蒸馏水，然后用解剖针切取乳白色的根尖，用滴管吸取适量的改良的石碳酸品红染液滴加到根尖上[7]，染色时间为8min，染色结束后用胶头滴管吸取45%的醋酸溶液洗片，接下来取一张干净的盖玻片盖在分生组织上，用吸水纸吸取多余的溶液，在盖玻片上覆一张吸水纸，用大拇指轻轻按压，把根尖均匀的压散后，用指尖进行刮片，使染色体均匀分散开，便于观察；将压好的装片置于显微镜下观察，把效果好的装片贴上标签备用。

1.2.6 制作永久装片。冷冻法揭片：将装片放入冰箱中冷冻，24h后取出，迅速用解剖刀将盖玻片揭下来，待载玻片与盖玻片都干燥，用玻璃棒蘸取米粒大小的中性树胶滴在载玻片上，用镊子夹住盖玻片，按照揭片时留下的痕迹再重新盖回去，然后将装片放在水平的位置自然干燥，待中性树胶干燥之后，即完成永久装片的制作[8]。

1.2.7 镜检及图像采集。用电子显微镜观察永久装片，找到中期染色体，由于染色体非常小，所以需要借助油镜观察，在装片上滴加镜油(液体石蜡)然后转换100倍的物镜观察，用数码相机取染色体分散良好、着丝点清晰的图像进行显微摄影,拍下有丝分裂各时期的图像和分散较好的一组中期染色体图像，冲洗放大后得到染色体清晰的照片。

1.3 多倍体的诱发及制作装片

将玉竹幼苗洗净后分为3组，以0.1%的秋水仙素为诱变剂，第一组和第二组分别采取脱脂棉包裹法和浸渍法，诱导玉竹幼苗根尖的染色体加倍：将第三组玉竹幼苗栽于花盆中培养，作空白对照。定期对上述3组玉竹幼苗，补充秋水仙素及水分，检查第一组和第二组玉竹幼苗根尖变化情况以及第三组玉竹幼苗生长状况；2周后待根尖末端膨大，长度达到1～3cm时进行固定：于上午9:30～10:30取出玉竹幼苗，用解剖刀切取嫩根尖1cm，将根尖放入装有蒸馏水的培养皿中水洗3次，将水洗过的根尖放入装有卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)的广口瓶中，固定24h,将水洗过的根尖放入65%乙醇溶液中保存。将根尖放入盛有多半杯解离液(浓盐酸∶无水乙醇=1∶1)的烧杯中,置于 61～62℃的恒温水浴锅中, 恒温处理 12～21min,取出小烧杯，用镊子将根尖转移到装有蒸馏水的培养皿中水洗4次, 每次2min，彻底洗去盐酸，镊子夹取根尖置于磨砂载玻片中央，用解剖刀切取根尖，吸水纸吸干水分，取改良的石碳酸品红染液滴加到分生组织上，染色时间8min，染色结束后用胶头滴管吸取45%的醋酸溶液洗片；盖片，覆一张吸水纸用指尖刮片，使染色体分散均匀；将装片放入冰箱中冷冻24h后，取出并揭下盖玻片，待玻片干燥，用玻璃棒蘸取米粒大小的中性树胶滴在载玻片上，按照揭片时留下的痕迹将盖玻片重新盖上，水平放置使其自然干燥，待中性树胶干燥后收起备用；镜检时，用数码相机进行显微摄影，拍下分散较好的各时期染色体图像。

2 结果与分析

玉竹(多倍体)染色体计数。

图1 玉竹(四倍体)

用0.1%的秋水仙素处理过的玉竹幼苗，诱发得到的多倍体的根尖与二倍体在外部形态上有所不同，其分生区膨大，短小而粗壮，制作永久装片后，通过显微摄影，采集加倍的玉竹有丝分裂中期的染色体图片，冲洗照片如图1。

自然条件下玉竹幼苗中期染色体图片如图2

通过观察并计数发现，用0.1%的秋水仙素诱发的玉竹的染色体数目2n=4x=40，而自然培养的玉竹染色体数目为2n=2x=20，证明此多倍体为四倍体，染色体发生加倍。

图2 玉竹(二倍体)

3 结论与讨论

3.1 结论

自然条件下，玉竹染色体数目为2n=2x=20，二倍体核型公式为2n=2x=16m+6sm，而用0.1%的秋水仙素处理玉竹幼苗，诱发多倍体，通过根尖压片方法对玉竹进行染色体计数，结果显示染色体数目为2n=4x=40，说明诱发出了四倍体。通过对比发现，采用脱脂棉包裹的玉竹幼苗根尖加倍效果明显，但发生加倍的根尖较少，采用浸渍法的根尖基本全部发生加倍，但效果较浸渍法略差。原因可能为脱脂棉包裹法大致还原了玉竹的生长环境，适于其生长。而浸渍法玉竹根尖呼吸不充分，因此效果略差。

3.2 讨论

目前，秋水仙素(colchicine)是诱变多倍体最好的药剂之一，广泛应用于多倍体诱发上，秋水仙素的作用是通过与微管蛋白二聚体结合,而使纺锤体微管蛋白不能继续聚合 ,并引起原有纺锤体微管解聚，染色体不能向两极移动，染色单体就不分裂，使得染色体数目加倍，形成多倍体。由于秋水仙素诱变作用只在细胞分裂时期，对于那些处于静止状态的细胞没有作用，因此，本实验以玉竹幼苗根尖为实验材料，诱导染色体数目加倍。

目前生态环境破坏严重，野生药用植物资源逐渐减少甚至枯竭，加强药用植物多倍体培育,可以缓解这些问题。因此,多倍体诱导技术应用于药用植物具有深远的意义。近年来，玉竹的人工栽培逐渐受到人们重视，具有极高的市场价值潜力。玉竹的成功加倍，会提高人工栽培的产量和品质，有很好的经济效益，同时对玉竹的遗传育种也提供了理论基础。