润楠过氧化物酶对水环境中双酚A的清除

高艳芳，王楠， 王雨雪，肖强

(1. 生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院)，湖北 恩施 445000；2. 湖北民族学院林学园艺学院，湖北 恩施 445000)

樟科(Lauraceae)润楠属(MachilusNees)植物，主要分布在亚洲东南部和东部热带、亚热带地区，约有100种，中国是其分布中心，记载有68种3变种，集中分布于长江以南各省(区)。润楠属植物是我国南方主要的经济林木，大部分种类是热带及亚热带森林的表征种，在园林绿化、药用、木材以及香料生产等方面占有重要地位[1-2]。润楠(Machiluspingii)是国家Ⅱ级重点保护野生植物，其树干挺直，具广阔的伞状树冠，木材细致，味芳香，为优良的行道树及庭院绿化树种，茎、叶、皮均可入药。我们前期研究木兰科植物多样性过程中发现，润楠叶中具有较高过氧化物酶活性。

过氧化物酶(Peroxidase.POD.EC.1.11.1.7)是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内发挥清除过氧化氢作用的重要酶类[3-4]。因其本身结构的特殊性以及对环境的友好性，目前，POD已被广泛应用于医药、农业、工业、环境等领域[5]。尤其是利用POD催化处理废水中低浓度、有雌激素效应的酚类化合物的方法引起了人们的广泛兴趣，进而在相关技术上进行了有效的探索[6-10]。例如对大豆POD(Soybean peroxidase，SBP)用于酚类物质清除的条件优化、动力学特性和反应机理研究[11]，充分展现了POD对水体中微量酚类污染物的清除具有的较好应用前景。

环境雌激素是一类通过干扰生物体自身激素的分泌、合成、代谢进而影响机体正常生命活动的环境化学物质，具有隐蔽性、迁移性、蓄积性、持久性等特点，作用机制复杂、影响范围广泛，严重威胁人类健康和生存[12]。双酚A(BispHenol A,BPA)化学名称2,2-二(4-羟基苯基)丙烷，又名二酚基丙烷，主要应用于生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等，是一种具有雌激素活性的环境内分泌干扰物，是世界生产量最大的化工原料之一，因其具有无色透明、耐用、轻便和防冲击性特性，广泛应用于液体容器、食品包装及各类医疗设备等[13]。但BPA在使用过程中会从材料中释放、泄漏出来，分布在大气、土壤和水环境中，通过水和食物进入动物和人体内，并结合细胞中的激素受体，引起内分泌系统紊乱，致使有机体出现多种机能障碍，危害人类健康，其毒性研究已经受到学者的高度关注[14]。Li等人发现，接触过多的BPA可能引发肥胖症[15]。Ahmadkhaniha等人研究证实，尿液中含有BPA越多，发生糖尿病的概率就越高[16]。Chapalamadugu等人研究表明，BPA会干扰胎儿心脏的相关因子转录，可能会引发一系列的心脏疾病[17]。日前，也有研究表明BPA可以增加实验动物的造血细胞的癌变和诱发睾丸肿瘤[18]，进一步的研究还证实BPA在小鼠身上表现为恶性乳腺癌致癌物质，并可能对人类也会产生相应的结果[19]。BPA无处不在，即使是低剂量染毒，也会造成严重的损伤；BPA具有生物富集、效用持久以及生理学响应浓度极低等特性，致使其在环境水体中很难通过传统水处理技术去除。当前，对环境中BPA的消除主要采用生物降解法[20]、光催化的化学降解法[21]、活性炭吸附法[22]以及生物酶降解法[23]等方法，基于生物酶降解法具有高效、绿色、反应条件温和等优点受到广泛关注。

为研究润楠成熟叶POD对环境水体中的污染物BPA的清除效果及实际应用前景，充分利用绿色资源，我们对润楠成熟叶POD进行了初步分离，得到性质稳定的粗酶液，在此基础上考察该酶对水体中的BPA去除效果及反应最佳条件。旨在探索一种利用POD处理含BPA废水的低成本途径，同时最大限度开发润楠叶用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以湖北民族学院人工栽植的20年龄润楠(Machiluspingii)，湖北民族学院林学园艺学院易咏梅教授鉴定，成熟叶为试验原料。

1.2 试验方法

1.2.1 润楠POD粗提。取润楠成熟叶，除去叶柄、主脉，称取700g。按照1∶6料液比加入提取液进行提取，提取液含2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-P)、20%硫酸铵(W/V)以及20%的聚乙二醇(PEG2000(W/V))，4℃匀浆，置于冷冻离心机4℃、5000r/min离心45min，转移至分液漏斗中静置萃取2 h，取下相(盐相)，再次离心，条件同上，进一步抽滤，滤渣丢弃，滤液转移至透析袋中，采用蒸馏水透析除盐，每8 h更换一次水，直至透析液用1% BaCl2检测无沉淀产生为止(一般在有磁力搅拌器搅拌的情况下，更换3次蒸馏水即可达到除盐效果)。脱盐后的酶液冷冻干燥保存待用。

1.2.2 POD酶活性测定。参考Amako[24]等的方法并稍修改，测定体系为4mL，包括1mL 40mmol/L愈创木酚，1mL 40mmol/L H2O2，1.9mL 100mmol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)。加入0.1mL酶液后启动反应，于波长470nm，30 ℃下记录OD值变化。1个酶活性单位定义为测定条件下每分钟OD470变化0.1所需的酶量。

1.2.3 蛋白含量测定。蛋白质含量测定采用 Bradford[25]染色法，以牛血清蛋白作标准蛋白。

1.3 BPA去除条件研究

研究最佳酶浓度时，柠檬酸缓冲液(50mmol/L，pH值6)，0.2 mg/mL的BPA溶液(后续实验均使用此浓度)、100μmol/L H2O2，反应温度25 ℃，设置酶浓度分别为50、100、150、200、300、500U/mL，之后对其它去除条件的研究，除变量外均采用此条件。研究最佳温度时，设置不同的反应温度分别为10、15、20、25、30、40、60℃恒温水浴条件下，对BPA清除效果展开研究。设定pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、11.0的柠檬酸缓冲液(50mmol/L)，对BPA清除效果展开研究。设定粗酶液与H2O2摩尔浓度比为1∶0.5、1∶2、1∶5、1∶7.5、1∶12、1∶20，润楠粗酶液对BPA清除效果研究。反应混合物置于恒温水浴锅中搅拌，加入1mL H2O2溶液启动反应，反应体系共20 mL。于反应0min(未加过氧化氢时)、1、3、5、15、45、90、120、180min取1mL反应溶液，加入2mL甲醇终止反应，即实现润楠叶对BPA的清除。加入100μL硫酸铝钾以终止反应，摇匀，过夜沉淀后5000 g离心10min。上清液过0.22μm滤膜后检测BPA浓度。

1.4 分析方法

Agilent公司ZORBAX C-18(2.1×50mm, 1.8μm)色谱柱。流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，35%乙腈等度洗脱，柱温25℃，体积流量0.2mL/min。ESI离子源负模式，干燥气温度350℃，流速10L/min；雾化器压力45psig，毛细管电压3500 V，毛细管出口电压150V，锥孔电压65V，采集速度1.5spectra/s，选择离子(EIC)采集方式，选定的分子离子[M -H]-的质荷比为227(BPA)。

2 结果分析

2.1 最佳清除酶浓度确定

分别考察50、100、150、200、300、500U/mL的润楠粗酶液浓度对BPA清除效果的影响。结果如图1所示。可见在同一时刻，随着反应体系酶浓度的升高，BPA最终剩余率不断下降，在20min时，50U/mL酶浓度清除效果可达60%，500U/mL可达到完全清除。在90min左右大于50U/mL的任意酶浓度去除BPA的效率达99%以上。由此可以看出，润楠POD对于催化去除BPA效果极佳，具有良好的应用前景。

图1 不同酶浓度对润楠叶过氧化物酶清除BPA的影响

2.2 不同温度条件对去除BPA的影响

分别在10、15、20、25、30、40、60℃条件下，考察温度对润楠POD催化去除BPA的影响，结果如图2所示。可见温度对于酶清除BPA影响较小，在短时间内均可达到高效清除。在10～60℃范围内3 h清除率可以达到99%，在25℃时清除效果极佳，表明该酶的热稳定性良好，有益于实际运用。酶促反应对温度具有高度敏感性，升高温度既可加速酶促反应又可加速酶的变性失活。上述温度条件下，润楠POD受温度影响很小，可在较低温度和较高温度下保持活性，具有很好温度适应范围。

图2 不同温度条件对润楠叶过氧化物酶清除BPA的影响

2.3 pH对去除BAP的影响

设定pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、11.0的反应条件(50mmol/L)，考察不同pH对去除BPA的影响，结果如图3所示。可见，pH值为4～7之间时，该酶促反应均无太大影响，在40min左右，对BPA的清除效果可达到99%。而pH值超出此范围时，pH对反应影响较大， 显著降低了对BPA的去除效率。上述结果表明，在酸性到中性条件下，润楠POD具有良好的活性及稳定性，可以有效去除BPA。

图3 不同pH值条件对对润楠叶过氧化物酶清除BPA的影响

2.4 最佳清除H2O2/BPA摩尔浓度比比值确定

设定H2O2/BPA摩尔浓度比为1∶0.5、1∶2、1∶5、1∶7.5、1∶12、1∶20，考察不同H2O2/BPA比值对去除BPA的影响，所得具体结果如图4所示。从图4可以看出，在反应达到3 h时，在H2O2/BPA摩尔浓度比值为5～20时，BPA未能达到完全的清除，但均可达80%及以上。在比值为0.5时，3 h后清除率仅达60%，仅当H2O2/BPA摩尔浓度比值为2时，在3 h内去除率和去除反应速率随着浓度比的增大而减小，3 h后可完全清除，确定H2O2/BPA最佳摩尔浓度为2倍。

结果显示，不同的H2O2/BPA摩尔浓度比比值，对去除BPA有明显的区别。主要因为H2O2既是POD的底物又是POD的失活剂。刘海峰等研究表明，H2O2作为氧化剂，其初始反应浓度的高低直接影响对底物的催化反应效果，H2O2的浓度小于20mM时，最终产物浓度与底物OPD浓度呈正比例关系，但当H2O2的浓度大于20mM时，最终产物浓度不再与底物OPD浓度呈正比关系，说明此时过量的H2O2使HRP发生了更复杂的失活作用[26]。

图4 不同H2O2比例对润楠叶过氧化物酶清除BPA的影响

3 结论与讨论

POD是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与植物代谢及抗逆性都有密切关系[27-28]。董金龙等[29]对金银花过氧化物酶酶学性质研究表明，金银花最适温度是30℃，且该酶在10～40℃范围内稳定性较好，最适pH和pH稳定性研究表明酶的最适pH为5，酶在pH小于4的酸性环境下酶活力下降，pH值在4～7范围内有较好的稳定性。在本研究中，润楠叶POD在pH4～7内稳定性良好，温度在10～60℃范围酶活性无明显损失。与金银花POD较为接近，说明润楠POD具有优良的耐热性，有利于实际生产利用。

Duarte-Vázquez等[30]等研究了萝卜过氧化物酶(TP)对酚类物质的清除效果，结果显示，在pH4～8，温度25℃，H2O2浓度为0.8mmol/L条件下，经过3 h，1.28U/LTP对0.5mmol/L对BPA的清除效果可达85%，在本研究中，在pH4～7，温度10～60℃，H2O2/BPA摩尔浓度比比值为2的条件下，经过3h，润楠POD对0.2 mg/mL BPA清除率可高达99%及以上。与上述结果类似，润楠POD具有较宽的pH范围及良好的温度适应性，表明润楠POD具有工业应用的前景。

经过双水相萃取，从润楠成熟叶片中分离得到一种活性较高、性质稳定的POD。润楠POD清除BPA的最佳条件为酶浓度为300U/mL ，pH值6，接近中性，温度25℃ ，H2O2/BPA摩尔浓度之比为2时，其清除率达 95% 以上，最高可达99.9%的去除率。实验数据充分显示润楠POD具有较宽的pH和温度适应范围以及较高的去除率和抗有机污染能力，在酚类污染治理方面具有巨大潜力和商业价值。

在污水处理及污水循环利用的过程中，对含有BPA在内的废水的控制和清除，是非常紧迫和必要的，酶处理技术因作为一种绿色经济有效方法而值得探索研究，利用酶的催化氧化作用处理内分泌干扰物污染也是目前受到重视和看好的新兴技术。该技术可有效降低污水中低浓度有毒有机污染物，对筛选更高效经济的酶具有深远意义。