中国林蛙体内重金属与环境的相关性分析

韩曦英 朱健勋 于 澎

(长春中医药大学药学院，长春，130117)

中国林蛙(Ranachensinensis)是一种名贵的野生药用动物，主要分布于中国东北的长白山地区，为东北著名山珍。中国林蛙是食、药两用的珍贵蛙种，其营养价值高，被人们广泛利用，特别是蛤蟆油(Ranae oviductus)，俗称蛤蚂油、雪蛤膏、哈士蟆油等，是雌蛤蟆蛙输卵管的干制品，其味甘、咸，性平，归肺、肾经，具有补肾益精，养阴润肺之功效，用于阴虚体弱、神疲乏力、心悸失眠、盗汗不止、痨嗽咳血，自古在民间就是传世的滋补佳品。《中华人民共和国药典》1985年版到2015年版都收录了蛤蟆油[1]。

随着对中国林蛙的营养和药用价值越来越广泛的认识以及人们生活水平的提高，中国林蛙的人工养殖正在大力开展。但是重金属在动物体内容易发生蓄积[2-5]，生态环境的污染可能会导致环境中的一些重金属存留在林蛙体内，影响中国林蛙的药用、食用安全性。2014年肖井雷[6-7]等对中国林蛙体内重金属富集特征进行了研究，同时评测了中国林蛙栖息地的环境质量，发现重金属在中国林蛙体内有富集。

中国林蛙广泛分布在长白山区，在吉林省吉林市、延边州、通化市、白山市地区的林区分布广，数量最多[8]。吉林省农业大省的经济发展现状和产业结构特征决定了重金属的污染状况较轻，在省内局部水体、土壤重金属偶有超标现象，超标幅度较小。主要涉及地区有长春市、吉林市、四平市、通化市、白山市、白城市、延边州地区[9]。中国林蛙在生活过程中从水和食物中吸收并积累重金属元素。为进一步研究蛤蟆油原动物中国林蛙体内重金属蓄积与其生存环境中水和土壤中金属含量之间的相关关系，依照吉林省中国林蛙的主要分布地区与存在重金属污染的地区，在吉林省境内6个不同的中国林蛙产地采集活蛙样品以及其生存环境中的水样和土样进行重金属蓄积检测，即测定铅、镉、铜、汞、砷元素的含量，然后进一步用统计学的方法分析林蛙各部位重金属含量与生态环境中重金属的相关关系。其中6个采样地点分别于吉林市丰满区旺起镇、桦甸市桦郊乡、抚松县抚南镇、通化市东昌镇、汪清县东光镇、安图县福满沟明月镇。

1 材料方法

1.1 实验材料

在2015～2016年分别于吉林市丰满区旺起镇、桦甸市桦郊乡、抚松县抚南镇、通化市东昌镇、汪清县东光镇、安图县福满沟明月镇6个产地采集活蛙(雌蛙)样品，分别对中国林蛙的油、肝、骨及籽4个部分中的铅(Pb)、铜(Cu)、镉(Cd)、砷(As)、汞(Hg)5种重金属的含量进行测定，同时采集取样点的中国林蛙生存环境中流动水样、池中水水样、土样进行该4种重金属蓄积检测。

1.2 仪器和试剂

AFS-930双道原子荧光光度计(北京吉天仪器厂)、AA-6800原子吸收分光光度计(日本岛津实验设备公司)、SX2-8-10 实验马弗炉(天津天有利科技有限公司)。

盐酸、硝酸、高氯酸、硫酸、氢氧化钾、硼氢化钾、抗坏血酸、硫脲。

1.3 实验方法

砷元素及汞元素采用双道原子荧光光度计对行检测；铅元素、镉元素、铜元素采用原子吸收分光光度计进行检测[1]。

1.4 统计分析方法

应用偏最小二乘分析中国林蛙体内重金属含量与其生存环境重金属含量之间的相关关系。本文数据分析使用专业统计R软件进行分析。

2 结果

2.1 重金属检出限与含量标准

各个重元素用相应的仪器，平行进样得到平均值为最低检出限。铅、镉、铜、砷和汞的检出限分别为0.15 mg/L、0.01 mg/L、0.38 mg/L、0.003 mg/L、0.004 mg/L。

中国林蛙样本检测参照药用植物及制剂外贸绿色行业标准WM/T2-2004，水样检测参照我国地表水环境质量标准GB 3838-2002，土壤检测参照我国土壤环境质量标准GB 15618-1995，执行二级标准。

表1 中国林蛙体内及水样、土壤中重金属限量

Tab.1 The limit of heavy metals in the body，water and soil for Rana chensinensis

2.2 重金属检测结果

经测定，中国林蛙体内各个检测部位的铅、铜含量符合标准；镉在中国林蛙体内检测部位有超标现象；砷在中国林蛙体内检测部位基本未检出；汞在中国林蛙体内检测部位偶有超标。

中国林蛙体生存的水环境和土壤环境中铅含量符合标准；水环境中铜含量有超标现象；镉在中国林蛙生存的水环境和土壤中普遍超标；砷在水环境和土壤环境中即便偶有检出也符合含量标准；汞在环境中偶有超标情况。

中国林蛙体内、生存水样、土壤中的重金属检测结果见表2。

表2 中国林蛙体内、生存水样、土壤中的重金属含量

Tab.2 The quantity of heavy metals in the body，water and soil of Rana chensinensis

续表2

注：“-”表示低于检测限；“↑”表示高于限量。表格中数字保留小数点后3位

Notes：“-” Below detection limit；“↑”Higher than limit.The number in the table is three bits after the decimal point is retained

2.3 5种重金属在中国林蛙体内各部位与其生存环境重金属含量之间相关分析

针对5种考察的重金属(铅Pb、铜Cu、镉Cd、砷As、汞Hg)分别分析中国林蛙体内各种重金属含量和中国林蛙生存环境中的相应重金属含量的相关关系。

经检验重金属含量数据不服从正态分布(P<0.05)，且中国林蛙各个用药部位的重金属含量存在严重的共线性(VIF>10)，即各变量之间存在显著的相关关系使得采用普通最小二乘模型估计失真难以估计和解释，因此采用偏最小二乘回归分析方法进行分析。偏最小二乘方法(PLS)是一种多元统计分析方法，具备主成分分析、典则相关分析和普通最小二乘回归三者的某些特点，通过建立正交得分向量(或潜变量、成分、因子)间接拟合解释变量和反应变量之间的线性关系，能够在变量非正态分布、存在严重多重相关、样本点个数较少的条件下进行回归建模。

表3 模型PRESS值及累积贡献率计算结果

Tab.3 The results of the model PRESS and cumulative contribution rate

偏最小二乘回归算法可以通过均方预测误差根RMSEP(由留一交叉验证法计算的均方预测误差根)达到最小时所对应主成分数进行交叉验证验证成分个数选取是否合理。交叉验证结果表明主成分个数选取2时，均方预测误差根最小，结果见图1。图1中纵坐标表示均方预测误差根，横坐标为不同模型的成分个数。黑色实线代表留一交叉验证时训练样本的均方预测误差根，虚线代表留一交叉验证时预测样本的均方预测误差根，两条线比较接近，说明交叉验证效果较好(限于篇幅，图1中只表示出重金属铜在林蛙体内与生存环境重金属含量显著相关的部位：林蛙骨、林蛙籽)。

图1 成分个数选取交叉验证结果Fig.1 Selection of cross validation results by the number of components

经偏最小二乘分析，只有重金属铜在林蛙体内检测部位(骨、籽)的铜含量与其生存环境的铜含量之间有显著的相关关系(P<0.05)。文中只列出重金属铜的相应结果。其中因变量分别为中国林蛙骨中金属铜的含量和中国林蛙籽中金属铜的含量，3个自变量为中国林蛙生存环境中池中水、流动水、土壤中的金属铜的含量。偏最小二乘回归分析中显著的方程结果见表4。

表4 标准化偏最小二乘回归方程

Tab.4 Standardized partial least squares regression equation

注：回归方程中的变量均指标准化后的原始变量值

Note：The variables in the regression equation mean the normalized original variable values

由偏最小二乘分析结果可见，林蛙骨内铜的含量与其生存的池中水中铜的含量有显著的相关关系(P=0.02399<0.05)；林蛙籽内铜的含量与其生存的流动水中的铜的含量有显著的相关关系(P=0.0139<0.05)。

3 小结与讨论

3.1 小结

中国林蛙体内及生存环境中重金属铅、铜、砷、汞的含量基本上符合标准，特别是砷含量大多低于检出限；镉元素有超标情况。中国林蛙肝脏中总重金属含量较其他部位普遍偏高，应缘于肝脏的解毒作用，代谢过程中所产生的一些有害废物均肝脏蓄积造成。中国林蛙体内骨、籽中的重金属铜的含量与其生存环境池中水、流动水所含铜重金属之间有着显著相关关系(P<0.05)，究其原因，中国林蛙有接近半年的休眠时间，在休眠时间内中国林蛙在水下靠皮肤进行呼吸，因此造成其体内的某些部位的重金属的含量与其生存的水环境中的铜的含量有显著的相关关系。因此对环境中的重金属污染进行防治、治理，有利于中国林蛙的食用和用药安全。

3.2 讨论

重金属污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆转性等特点。重金属在人体内能和蛋白质及各种酶发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒等，对人体会造成很大的危害[10-13]。

中国林蛙体内重金属含量直接影响其食用及用药安全。以往文献主要关注中国林蛙体内重金属含量测定、富集特征以评价其食用用药安全性[6，14-16]，或对中国林蛙栖息环境的质量进行评价[7]。虽然根据以往文献调查研究发现中国林蛙体内的重金属含量普遍符合食用用药重金属含量安全标准，但是探究分析中国林蛙体内重金属相关来源、影响因素，对控制中国林蛙体内重金属含量、提高中国林蛙用药安全性以及进一步有针对性的防治重金属污染都有着十分重要的意义。

文中在实验测定中国林蛙体内重金属含量及其生态环境中重金属含量的基础上，利用偏最小二乘的方法分析其重金属含量相关性，结果两者之间存在一定的相关关系。说明中国林蛙生存环境中的重金属污染会在一定程度上影响中国林蛙体内的重金属含量。因此必须通过增强环保意识，坚决杜绝工业“三废”的排放，规划城市垃圾的堆放，严格控制含有重金属的化肥农药的使用等，从而有效地控制环境中的重金属污染。

偏最小二乘分析进行分析能够克服数据非正态、样本量小等困难进行多变量之间的相关分析，且在自身的算法中能不断进行交叉验证核实，具有一定的可靠性和创新性。该方法可以进一步地推广应用到药用动植物体内重金属含量与其生存环境的重金属含量的相关性分析。