异源性单、多克隆血型检测抗体对大熊猫红细胞检测的探索性研究

赵俸涌邓林华杨乾李德生魏荣平黄山魏明李勤钱旻朱自严

(1.华东师范大学生命科学学院，上海，200241；2.上海市血液中心，上海，200051；3.中国大熊猫保护研究中心，都江堰，611830)

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)是中国特有的珍稀野生保护动物，随着大熊猫数量增加，大熊猫疾病救治的压力也随之增大。在大熊猫疾病救治及野外抢救中，输血治疗十分重要。临床输血中关乎输血安全及有效性的核心问题是血型配合，人类血型的研究已相当透彻，其他家养动物的血型系统，也有较深入研究。大熊猫血型系统研究甚少，报道仅仅见于大熊猫输血急救的案例报道中[1-8]，故而国内外尚无针对大熊猫红细胞分型的结论，亦缺乏大熊猫血型系统的定型试剂。

人类血型定型实验中，常使用同源性抗血清(多克隆抗体)及异源性单、多克隆血型定型抗体对红细胞进行定型实验。在探索大熊猫红细胞血型抗原的研究中，已有研究人员使用人类血清学血型试剂作为大熊猫红细胞血型定型试剂对大熊猫红细胞进行血型分型得到以下结论：在刁玉英等的研究中，使用人源性抗血清作为定型试剂对大熊猫红细胞进行检测，发现大熊猫与人源性抗M血清发生凝集，得到大熊猫红细胞具有M抗原的结论[8]；在随后的研究中，蔡紫珍等、王德春等、陈玉村等通过大熊猫血液与人类ABO血型系统定型试剂的血清学反应结果，得到大熊猫红细胞血型类似人类O，Rh+型的结论[5-7]。但由于以上研究中并没有考虑到使用异源性定型试剂时，试剂中的种间抗体对于实验的影响，故异源性单、多克隆抗体在大熊猫红细胞定型实验中是否能发挥作用，还存在疑问。基于以上原因，本研究使用人类血型定型试剂对大熊猫红细胞进行检测并使用小鼠与人类血液、亚洲黑熊(Ursusthibetanus)血浆作为实验材料，对异源性试剂与大熊猫红细胞反应性进行实验，对历史文献中的结果及本研究中的实验结果进行验证。

1 材料和方法

1.1 材料

本实验中所有实验流程按照AABB标准流程进行[9]。

1.1.1 血液来源及抗凝方法

本实验大熊猫血液样本采集自中国大熊猫保护研究中心的健康圈养大熊猫(2015年第一批次采样；2016年第二批次采样)，血液样本采集后使用EDTA·K2抗凝。

1.1.2 主要试剂及仪器

人类抗A抗B抗体及人类A，B，O试剂细胞、抗-M、抗-N、抗-D、抗-E、抗-e、抗-C及抗-c抗体购自上海血液生物医药责任有限公司；KA-2200血型离心机购自日本久保田公司，2420离心机购自日本久保田公司。

1.2 实验方法

1.2.1 血液采集及分离

本实验涉及血液样品均通过中国大熊猫保护研究中心及上海市血液中心伦理审查。大熊猫全血血样来自中国大熊猫保护研究中心的圈养大熊猫，经行为训练后，所有血样采用非麻醉采血方式获得。使用10 mL及20 mL一次性针筒采血，采集到的大熊猫血样存放至5 mL EDTA·K2抗凝采血管中。小鼠血液来源为C57 bL/6小鼠，由本室杨启修实习研究员馈赠。人血浆为检验合格后的废弃血浆样品(O型及AB多人份混合；新生儿红细胞为单人份)，亚洲黑熊血浆由福州大熊猫研究中心馈赠。

所有抗凝全血获得后，按照AABB标准流程，通过离心2600 g，5 min对血浆和红细胞压积进行分离，红细胞压积使用生理盐水洗涤3次后(血清学离心机3档)被制作为2%～5%的红悬液进行下一步实验，血浆直接被用于检测。

1.2.2 血液配合实验(交叉配血实验)

使用红细胞悬液与血浆(异源性多克隆抗体)进行血液配合实验：红细胞悬液和血浆以1∶1比例混合，在室温条件下直接离心。使用血清学离心机2档离心，离心后对结果进行判读，判读标准如下(图1)。

IgM类异源性单克隆抗体(人类血清学血型试剂检测)：红细胞悬液和血型试剂以1∶1比例混合，在室温条件下直接离心。使用血清学离心机2档离心，离心后对结果进行判读，判读标准如下(图1)。

图1 血清学实验打分标准Fig.1 The scoring standard of agglutination strength in BCMTA：4+；B：3+；C：2+；D：1+；E：1+w；F：阴性(-)；G：混合视野(MF)；H：溶血A：4+；B：3+；C：2+；D：1+；E：1+w；F：Negative(-)；G：Mix field(MF)；H：Hemolysis

2 实验结果

在本实验中，使用了人类ABO血型系统定型试剂对2015年获得的11份大熊猫血样中的7例大熊猫红细胞进行了检测、使用MN血型系统定型试剂及Rh血型系统常见血型试剂对2016年获得的10例大熊猫红细胞进行检测；使用人类ABO系统标准试剂细胞对2015年获得的11份大熊猫血样中的7例获得的大熊猫血浆进行检测。发现大熊猫红细胞与抗-A、抗-B抗体剂均不发生凝集(表1)，而大熊猫的血浆与人类A型、B型血清学试剂细胞均发生凝集，与O型试剂细胞凝集略弱，与O型新生儿红细胞凝集最弱(图2)。大熊猫红细胞未与MN系统，Rh系统血型检测抗体反应(表2)。

由于使用人类血型定型试剂对大熊猫红细胞及血浆进行检测，呈现出全部阴性或全部阳性的结果，且文献中报道中对M抗原的检测，使用人源性抗血清与大熊猫红细胞检测呈阳性，为了验证以上结果是否是由种间抗体造成的。本实验中使用了人类O型混合血浆及AB型混合血浆，小鼠血浆及亚洲黑熊血浆对大熊猫血液进行了交叉配血检测。小鼠血浆与大熊猫红细胞配合性试验(交叉配血)格局呈现全部阴性(表3)；人类血浆与大熊猫及小鼠红细胞的合性试验(交叉配血)呈现全部阳性的格局(表3)；亚洲黑熊血浆与大熊猫红细胞配合性试验(交叉配血)呈现一部分阴性一部分阳性的结果。

表1 大熊猫红细胞及血浆与人类ABO定型试剂试验(n=7)

Tab.1 Experiments of ABO blood typing reagents with giant panda blood

注：上述表格中使用抗-A、抗-B对大熊猫血液中红细胞进行检测，使用ABO试剂细胞对大熊猫血浆进行检测；ND表示没有进行检测；n=7：本批次共获得11例大熊猫血样，但由于4例血样总量较低，并未进行试验，故样本数为7例

Note：Anti-A and anti-B reagents were used in the detection of giant panda RBC，while ABO reagent cells were used in detection of giant panda plasma；ND means not detected；n=7：In the 2015，11 blood sample were got，but only 7 whose volume were sufficient were detected in this study

表2 大熊猫红细胞与人类Rh&MN系统血清学检测试剂试验(n=10)

Tab.2 Experiments of human Rh&MN blood group typing reagents with giant panda red blood cell

注：n=10：大熊猫血样样本数为10例

Note：n=10：10 cases of giant panda RBC were used

图2 大熊猫血浆与人类ABO定型试剂细胞凝集反应现象Fig.2 Agglutination experiments between giant panda plasma with human ABO typing standard cell A：不同个体大熊猫血浆与人类A型试剂细胞检测；B：不同个体大熊猫血浆与人类B型试剂细胞检测；C：不同个体大熊猫血浆与人类O型试剂细胞检测；D：不同个体大熊猫血浆与人类O型新生儿红细胞检测 A：The reaction between different giant panda plasma and human type-A cell；B：The reaction between different giant panda plasma and human type-B cell；C：The reaction between different giant panda plasma and human type-O cell；D：The reaction between different giant panda plasma and human neonatal type-O cell

表3 大熊猫红细胞与异源性血浆交叉配血格局图(n=6)

Tab.3 Cross matching pattern of between giant panda red blood cell and heterologous plasma at room temp

注：n=6：大熊猫血样样本数为6例

Note：n=6：6 cases of giant panda RBC were used

3 讨论

图2和表1的结果表明，使用人类血型定型抗体及人类血型试剂细胞对大熊猫血液进行检测，大熊猫红细胞与人类抗-A及抗-B，反应呈全部阴性(表1)。大熊猫血浆与人类ABO血型系统试剂红细胞室温下即发生凝集(表1，图2)。说明大熊猫血浆中存在与人类红细胞发生反应的抗体，从该抗体可与3种血型的人类血型试剂细胞发生反应的结果来看，该抗体并不是针对ABO血型系统某一特定抗原表位，从而无法说明文献中大熊猫红细胞类似人类O型的结论[5-7]。从表2中可以发现，使用人类Rh及MN血型系统试剂对大熊猫红细胞进行检测，反应结果全部呈阴性，与文献报道的大熊猫具有M血型抗原物质结论不一致[8]。以上实验结果说明使用人类ABO、Rh及MN血型试剂无法对大熊猫红细胞进行定型。

在大熊猫血液与小鼠及人类血液交叉配血结果中可发现，小鼠血浆对大熊猫红细胞不具有反应性(表3)；人类AB、O型多人份混合血浆与小鼠大熊猫红细胞交叉配血中，呈现全部阳性的血清学凝集格局(表3)，这一格局很显然是由于种间抗体，而非血型抗体造成的。亚洲黑熊血浆与大熊猫红细胞的反应，表现出同一只熊猫与不同亚洲黑熊血浆凝集结果不同，不同亚洲黑熊血浆与大熊猫红细胞凝集结果不同，说明亚洲黑熊血浆与大熊猫红细胞的凝集是由血型抗原抗体反应造成的，而非种间抗原(表3)。这也进一步解释了在本实验中，使用单克隆抗-M抗体并没有凝集发生(表2)，而文献中使用人源性抗-M抗血清可引发大熊猫红细胞凝集反应，其原因是人源性抗血清中的种间抗体与大熊猫红细胞发生了假凝集，导致对凝集的原因的错误判断[8]。

使用血型定型试剂对血型定型的原理是，抗体特异性识别血型抗原的糖蛋白或蛋白结构，如人类ABO血型系统的检测试剂中，抗-A特异性识别抗原糖蛋白末端的N-乙酰半乳糖抗-B特异性识别抗原糖蛋白末端的半乳糖，由于很多哺乳动物亦发现存在类似的结构，如犬科(Canidae)及猫科(Felidae)动物的血型系统中，血型抗原的物质基础仍然是唾液酸及岩藻糖修饰的糖蛋白[10]，故若大熊猫存在相应类似结构的抗原，使用类似的抗体存在鉴定出该抗原的可能性如果该抗体可以特异性识别。而在本研究中，小鼠源性的人类血型单克隆抗体无法检测大熊猫红细胞膜上的血型抗原蛋白，其原因有可能是由于大熊猫血型蛋白结构与人类相差较大，导致专一识别人类血型抗原构象无法识别大熊猫红细胞血型抗原。

同时，从亚洲黑熊血浆与大熊猫红细胞相容性实验结果来看，一部分亚洲黑熊可能与大熊猫血液配合，存在作为大熊猫异种输血血液来源的可能性。

由于大熊猫红细胞有限，本实验中并没有使用针对同一抗原的不同细胞株的抗体对大熊猫红细胞进行检测，故大熊猫是否具有与人类血型抗原结构相近似的血型抗原，都有待进一步证实。

4 结论

在大熊猫输血配合实验的定型中，由于种间抗体的干扰以及抗原结构空间结构的不同造成的不识别，异源性单、多克隆抗体(人类血型分型试剂)不可作为大熊猫红细胞分型试剂使用。历史文献中使用人类血型定型试剂对大熊猫红细胞血型进行检测，由于无法排除检测中因种间抗体引发的假阳性结果，故其得出的大熊猫具有M抗原及大熊猫红细胞分型类似人类O，Rh+型的结论不成立。