利用肝脏指数鉴别人工饲养和野生王锦蛇的研究

林煜田静茹崔杰李力徐艳春杨淑慧

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040；2.湖南省野生动物救护繁育中心，长沙，410000；3.国家林业局野生动物保护与利用工程技术研究中心，哈尔滨，150040)

蛇类具有很高的经济价值，广泛应用于美食、传统医药、服装、工艺品加工等行业。如今，由于过度利用、栖息地丧失、人类干扰等多种原因，野生蛇类的生存一直受到威胁[1]，种群数量大幅度减少，很多物种已无法作为资源使用。为此，我国的林业部门推行了一系列保护政策，防止野生蛇类被过度利用[2]。但因为传统文化和传统医药等原因，人们对蛇类的利用无法停止，我国从2006年展开了蛇类人工驯养繁殖技术试点工作，推动蛇类人工养殖产业的发展[3]，希望以养殖蛇类替代野外资源。目前，我国南方许多省份的养蛇业已经颇具规模，很大程度上缓解了野生种群的开发压力。但是新的问题也随之出现：随着蛇类养殖产业的不断扩大，蛇类及其产品的相关贸易市场被放大，在经济利益的驱使下，一些投机分子将野外盗捕的蛇类假借人工饲养的名义进行贩卖[4]。如果无法正确区分野生蛇和人工饲养的蛇，执法者就无法甄别违法犯罪行为，盗猎的蛇类就会在合法养殖业中被洗白，从而使养殖业成为盗猎活动的保护伞[5-7]。所以，鉴别蛇类来源于养殖场还是野外是保护野生资源的关键。

目前鉴别野生和人工饲养动物的方法主要包括稳定同位素比例[8-10]、脂肪酸谱[11]、金属元素含量[12]、骨密度[13-14]、骨骼形态[15-16]以及DNA遗传标记等[17-18]，但可用于蛇类鉴别的方法则十分有限，只有世界自然保护联盟(IUCN)在2015年针对濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录中的蛇类提出了一些区分方法，如野生蛇对饲养条件适应性差引起的综合症状、对饲养蛇类体表的理化标记或印记、微芯片标记、卵壳长宽比的差异、人工选育产生的特殊斑纹、野蛇常有的肠道寄生虫、DNA标记以及C稳定同位素相对含量等[19]。但是除了稳定同位素比例以外，其他的方法都具有非常特定的适用条件，不能作为通用方法[20]。尤其是在执法过程中，蛇类往往不完整，不具有这些特殊的印记、标记等线索，这些方法就无法应用。因此，亟待建立具有通用性的来源鉴别方法。

在比较野生蛇类和人工饲养蛇类的差异时发现，养殖蛇类的饲料都是营养水平较高的配合饲料[21]，饲料的营养素配比会影响脂肪代谢。养殖过程中饲料足量供应[22-23]，但养殖空间狭小，运动量少，因而，蛇类在饲养条件下容易积累脂肪[24，25]。身体脂肪的积累伴随着肝脏中脂肪大量沉积[26]和肝脏体积增大。相比而言，野生蛇类活动空间大，因搜寻猎物、捕食、逃避天敌、寻找或竞争配偶等，运动强度相对高，但是食物来源不稳定，有时甚至处于饥饿状态，所以相对于人工饲养的蛇类的肝脏脂肪沉积量低。

鉴于野生和人工饲养蛇类在肝脏脂肪沉积量和肝脏大小上存在明显的差异，可以此为基础，建立鉴别指标。为了检验这一推测，我们选择在中国广泛饲养和利用的王锦蛇(Elaphecarinata)作为研究对象，以肝脏大小为基础，建立两个具有来源鉴别意义的指标，并进行了鉴别效果的评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料与测量方法

从湖南省的养蛇场随机采集27条人工饲养的王锦蛇，其中雌性16条，雄性11条，年龄在1.5～2岁之间。另从该省盗猎案件中收缴的野生王锦蛇32条，其中雌性26条，雄性6条，根据体型判断为成年蛇。

根据动物福利原则，将蛇用乙醚深度麻醉致死[27]。按照标准方法测定体长(Ls-v)、头长(Lh)、头高(Hh)、下颌宽(Wm)、鼻间距(Si)[28]，Ls-v精确到0.1 cm，其余量度精确到0.1 mm。将蛇腹部剖开，取出肝脏和腹腔中的脂肪，用电子天平称量肝脏质量(Ml)和腹腔脂肪质量(Maf)，均精确到0.1 g。

1.2 数据分析

1.2.1 各量度间关系的分析

用鼻间距Si、下颌宽Wm、头长Lh和头高Hh所构成的立方体来估算头部体积(Vh)，如图1所示，计算公式如下：

蛇的身体可以粗略地看作圆柱体，身体体积(Vb)用头高(Hh)作为直径，以体长(Ls-v)为长度来估算，计算公式如下：

采用线性回归方法分析Vh和Vb的关系、Ml与Maf的关系、Ml与Vh的关系，以及Ml与Vb的关系，分别得出相应的线性回归方程y=ax+b。

图1 王锦蛇头部体积参数示意图Fig.1 Diagram of measurements for estimation ofhead volume of the king rat snake

1.2.2 蛇来源鉴别指标的构建

以肝脏质量(Ml)分别与头部体积(Vh)和身体体积(Vb)构建两个比值，分别称为肝-头指数(Ilh)和肝-体指数(Ilb)，意义是肝脏相对于头部体积和身体体积的密度，其单位定义为g/cm3。如果Ilh和Ilb在野生个体与人工饲养个体之间存在显著差异，就可以用这两个指标来鉴别王锦蛇的来源。

先用Kolmogorov-Smirnov Test检验野生组和饲养组的各项量度和计算值是否符合正态分布(α=0.05)，符合正态分布后直接进行组间的均值比较，否则进行正态化转换后再进行均值比较。Ilh和Ilb的组间均值比较采用独立样本t检验，显著水平为α=0.05。若指标在组间存在显著差异(α=0.05)，则采用Fisher判别计算其对已知来源样品的正确回判率，用以评估该指标在野生和人工饲养王锦蛇的判别能力。数据统计分析均使用SPSS 19.0软件完成。

2 结果

2.1 各项量度的描述性统计

野生组和饲养组王锦蛇的Ls-v、Lh、Hh、Wm、Si、Ml、Maf等各项量度和Vh、Vb两个计算值的统计结果如表1。经K-S检验，各项量度和计算值在野生组和饲养组都符合正态分布(P=0.209～0.982)，故此，可直接进行独立样本t检验来比较均值。结果显示，Ls-v、Lh、Hh、Wm、Si、Vh、Vb野生组显著大于饲养组(0.000

表1 野生组和饲养组王锦蛇的各项量度的均值差异显著性检验(均值±SD)

Tab.1 Comparisons of measurements between wild and farmed king rat snakes(mean±SD)

2.2 各项量度间的关系

采用线性回归方法分析Vh和Vb的关系、Ml与Vh的关系，Ml与Vb的关系以及Ml与Maf的关系，得出线性回归方程y=ax+b。如果肝脏质量与腹腔脂肪积累量存在明确的正相关，那么，肝脏质量就可以体现野生组和饲养组能量摄入和支出差异的可靠指标，进而以其为基础建立来源鉴别指标。将Ml与Waf做线性回归分析显示，二者在饲养组和野生组均呈极显著的正相关(饲养组R2=0.779，野生组R2=0.366；P值均为0.000)，而饲养组Ml随Waf的变化速度高于野生组(野生组a=0.153，饲养组a=0.284，如图2A)。这一趋势显示，肝脏质量在一定程度上显示出动物营养状况的差异，饲养组的营养状况好于野生组，而肝脏质量也随之加大，并随着营养状况的提高，肝脏质量提高迅速。

结果显示，无论是野生组还是饲养组，Vh和Vb之间均存在着显著正相关关系(野生组R2=0.781，饲养组R2=0.668，P值均为0.000)，而且两组间的关系非常相似(图2B)，这说明王锦蛇头部的大小和身体体积大小相关性很高，因此，无论在野生组和饲养组，头部体积都可作为体型大小的忠实指标。这样，肝-头指数就和肝-体指数一样，能够有效消除个体大小对肝脏质量比较的影响。

将Ml分别与Vh和Vb做线性回归分析，结果显示，野生组和饲养组的Ml均与Vh呈显著正相关(野生组R2=0.348，饲养组R2=0.369；P值均为0.001)，但两组的变化趋势不同，饲养组的Ml随Vh增加的速度高于野生组(饲养组a=5.115，野生组a=1.957)，但是两组的截距相差不大(饲养组b=-11.245，野生组b=-2.767，如图2C)。Ml和Vb的线性回归也显示出显著正相关的趋势(野生组R2=0.367，P=0.001；饲养组R2=0.293；P=0.004)，并且饲养组的Ml随Vb增加的速度也高于野生组(饲养组a=0.169，野生组a=0.068)，同样截距的组间差异较小(饲养组b=1.567，野生组b=1.308，图2D)。这一趋势表明，蛇的Vh和Vb较小时，Ml对野生组和饲养组的区分能力十分有限，但在当Vh和Vb较大时，其区分能力越来越大。

2.3 Ilh和Ilb的组间差异和性别差异

野生组中，肝-头指数Ilh为(1.789±0.533)g/cm3；饲养组中，Ilh为(4.043±1.582)g/cm3。K-S检验显示，Ilh在野生组和饲养组中均符合正态分布(P>0.05)。独立样本t检验显示，饲养组的Ilh极显著大于野生组(|t|=7.073，P=0.000)。野生组的肝-体指数Ilb为(0.072±0.023)g/cm3；饲养组的Ilb为(0.177±0.072)g/cm3，饲养组亦极显著高于野生组(|t|=7.285，P=0.000)。

此外，Ilh和Ilb在野生组和饲养组都存在显著的性别差异(表2)，雌性极显著高于雄性(野生组的Ilh：P=0.046，Ilb：P=0.037；饲养组的Ilh：P=0.016；Ilb：P=0.009)。

图2 野生组和饲养组Ml与Maf(A)、Vh和Vb(B)、Ml与Vh(C)以及Ml与Vb(D)的相关性的比较Fig.2 Inter=group comparison of correlation between Ml and Maf(A)，Vh and Vb(B)，Ml and Vh(C)，and Ml and Vb(D)● 野生组；○ 饲养组● Wild group；○ Farm group

表2 野生组和饲养组的Ilh和Ilb在性别差异性比较

Tab.2 Comparison of inter-sex differences of index Ilh and Ilb between wild and farm groups

2.4 Ilh和Ilb对来源的判别力

当不考虑性别差异时，直接检验两组样本Ilh和Ilb的正确回判率(%)，Ilh和Ilb指标在野生组判别正确率均为96.9%，饲养组为74.1%，整体为86.4%。虽然如此，因为两个指标均存在显著的性别差异，野生组的雌性与饲养组的雄性之间数据重叠度比较大，进行来源回判时，Ilh和Ilb在野生组雌性正确判别率均为96.2%，饲养组雄性均为63.6%，整体正确判别率均达到86.5%，可见野生组雄性的错判风险很高(表3)。如果性别已知，对同一性别之间进行判别，对于雄性来说，Ilh和Ilb对野生组的正确判别率均达到100%，饲养组均达90.9%，整体均为94.1%。对两组的雌性进行判别时，Ilh对于野生组正确判别率达到100%，饲养组为81.3%，整体为92.9%；Ilb对于野生组正确判别率达到96.2%，饲养组为81.3%，整体为90.5%。可见性别已知时的判别率大大提高。

表3 Ilh和Ilb指标对王锦蛇来源的判别力(正确回判率%)

Tab.3 Power of origin assignment(correctness，%)of Ilh and Ilb in the king rat snake

3 讨论

爬行类在营养过剩和运动量不足时，会导致肝脏中脂肪过渡沉积，从而使肝脏质量增加[29-30]。我们观察发现，如果饲养条件下，蛇类的营养供应充分，而又始终生活在狭小的笼舍内，运动量很小，其肝脏质量有增加的趋势。本研究显示，在消除体型大小影响后，比较野生组和饲养组肝脏质量时，饲养组极显著高于野生组，印证了我们的推测。

近些年，蛇类养殖逐渐实现了规模化、集约化和标准化[31]，养蛇技术的发展方向始终在于追求较高的饲料报酬，而开发营养平衡饲料和充分饲料供应都是提高饲料报酬的核心措施。因此，人工饲养的蛇类营养状况始终会高于野生蛇类，这就为采用肝脏质量来鉴别蛇类的来源提供了稳定的环境基础。

采用肝-头指数和肝-体指数可以消除体型大小的影响。Fisher’s判别分析显示，在野生组和饲养组，Ilh可将96.9%的野生组个体正确回判，将74.1%的饲养组个体正确回判，整体正确率为86.4%。Ilb的正确回判率在野生组为96.9%，饲养组为74.1%，整体为86.4%。这说明整体上讲，这两个指标是比较有效的来源鉴别指标。

影响正确回判率的因素除了个体间差异以外，就是两个指标在性别间的差异，不仅饲养组显著高于野生组，而且雌性高于雄性(表2)。这样一来，野生组的雌性与饲养组的雄性的数值就比较接近，从而导致判别错误。将野生组雌性和饲养组雄性进行比较判别时，Ilh和Ilh仅能把63.6%的饲养组雄性个体正确回判，错判风险高达36.4%(表3)。

在这种情况下，实际鉴定中需要按照性别分别构建参考数据，将两组的同一性别进行比较和判别，从而提高判别的正确率。譬如，本研究中，对雄性进行判别时，Ilh对野生组的正确回判率为100%，饲养组为90.4%，整体达到94.1%。该指标对雌性判别时，野生组的正确回判率亦为100%，饲养组的为81.3%，整体仍达到92.9%。Ilb的情形与Ilh一致，同一性别的正确判别率高达90.5%(雌性)和94.1%(雄性)。

Ilb和Ilh的必要量度是肝脏质量、头部量度和体长，所以，适合于死亡个体的鉴定。尤其是Ilh只需要肝脏完整和头部完整即可，这对不完整个体比较便利。但是头高、下颌宽等有时受标本形变的影响而不易测准，测定时应注意把标本回复到自然状态下。