血清炎性活动指标、Th17/Treg细胞在溃疡性结肠炎患者中的改变及其临床意义

马海芹， 赵小静， 张红杰

南京医科大学第一附属医院消化科，江苏 南京 210029

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种累及直肠、结肠的慢性反复发作的非特异性疾病，是炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的主要临床表型之一，其在经济高度发达的欧美国家多见，但近年来我国的患病率有明显增加的趋势[1-2]。UC的发病机制尚不完全明确，目前认为是基因易感、肠免疫紊乱、肠道菌群失调和环境等因素共同作用导致[3-4]，其中肠道免疫紊乱在UC的发病中起关键性作用[5]。Th17/Treg转化平衡是维持肠道免疫稳态的重要因素[6-7]，Th17细胞为近年来发现的CD4+T细胞亚群，可产生特异性炎性细胞因子IL-17、IL-21、IL-22等，在多种自身免疫疾病，如类风湿性关节炎、多发性硬化症等疾病中占主导地位[8]。Treg细胞也是CD4+T细胞亚群之一，共表达CD25和转录因子Foxp3，主要分泌IL-10和TGF-β，发挥抗炎和维持机体的免疫耐受功能[9]。Th17和Treg均由初始T淋巴细胞分化而来，并处于动态平衡当中，在IL-6与低浓度的TGF-β的环境下，Foxp3表达上调，平衡向Th17细胞分化，分泌促炎因子IL-17，导致炎症和自身免疫性疾病的发生[10]；而在高浓度TGF-β的环境下，平衡则向Treg分化[11]。本研究通过检测不同临床分期UC患者中Th17/Treg细胞比例，Treg细胞比例与血清炎性活动指标间的相关性，以及相关细胞因子IL-17、IL-10和TGF-β水平，初步探讨Th17/Treg细胞失衡与UC疾病活动及炎症程度间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2016年5月至2016年8月南京医科大学第一附属医院消化科收治的UC患者23例，其中活动期15例，男9例，女6例，年龄(41.13±15.65)岁(18～77岁)；缓解期8例，男6例，女2例，年龄(38.00±14.97)岁(14～60岁)。UC的诊断标准参照中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组制订的“炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年, 广州)”[12]。纳入8名门诊健康体检者作为健康对照，男4名，女4名，年龄(44.13±15.80)岁(20～59岁)。各组年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。疾病活动度评估：UC活动度的评估采用改良的Mayo评分系统[13]，≤2分且无单个评分>1分为缓解(n=8)，3～5分为轻度活动(n=4)，6～10分为中度活动(n=6)，11～12分为重度活动(n=5)。

1.2纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准：(1)粪便常规及培养排除肠道致病菌及真菌感染，通过相关检查排除结核分枝杆菌感染，以及巨细胞病毒、人类疱疹病毒4型、HBV、HCV、HIV等病毒感染；(2)尿常规及胸部X线片检查排除感染可能；(3)确定入组本研究前1个月内未使用抗生素。

1.2.2 排除标准：(1)存在自身免疫病、血液系统疾病、慢性肝肾疾病、恶性肿瘤以及合并严重心脑肺等疾病者；(2)妊娠。此项研究符合南京医科大学第一附属医院伦理委员会的规定，所有患者及健康对照者均签署知情同意书。

1.3试剂和仪器

1.3.1 试剂：抗人CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE、CD3-APC、CD8a-FITC、IL-17A-PE抗体、刺激阻断剂、固定破膜液均购自美国eBioscience公司。IL-17、IL-10和TGF-β ELISA试剂盒购自美国R&D公司。

1.3.2 仪器：Calibur流式细胞分析仪(美国BD公司)；酶标仪(美国Thermo公司)。

1.4方法

1.4.1 血清炎性活动指标检测：魏氏法检测ESR；散射光比浊法检测CRP；血细胞仪检测PLT计数、MPV和PDW。

1.4.2 Th17细胞的检测：采集UC患者和健康对照者空腹250 μl肝素钠抗凝全血，加入250 μl含质量浓度为150 g/L的胎牛血清的RPMI 1640和1 μl刺激阻断剂重悬细胞，体积分数为5%的CO2恒温培养箱培养4 h。取刺激后100 μl全血表面标记抗人CD8a-FITC、CD3-APC抗体4 ℃避光孵育25 min，分别加入MEDIUM A液和B液，室温孵育15 min，PBS清洗2次，表面标记抗人IL-17A-PE抗体 4 ℃避光孵育25 min，PBS清洗，重悬，待测。

1.4.3 Treg细胞的检测：采集UC患者和健康对照者空腹100 μl肝素钠抗凝全血，标记抗人CD4-FITC、CD25-APC抗体4 ℃避光孵育25 min，加入红细胞裂解液室温10 min，PBS清洗2次，固定破膜液4 ℃避光60 min，PBS清洗2次，标记抗人Foxp3-PE抗体4 ℃避光孵育25 min，PBS清洗2次。采用FACS Calibur进行检测及Flowjo 7.6 软件进行分析。

1.4.4 血清IL-17、IL-10和TGF-β含量的测定：采集UC患者和健康对照者空腹12 h外周血，3 000 r/min离心10 min后取上清，严格按照试剂盒说明书操作，酶标仪OD450读数。以读取的OD值为横坐标，用标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得出计算公式，根据公式计算各样品IL-17、IL-10和TGF-β的含量。

2 结果

2.1不同临床分期UC患者及健康对照者血清炎性活动指标的表达情况与缓解期UC患者相比，轻度、中度和重度活动期UC患者血清ESR及CRP水平均明显升高，MPV水平明显降低(P<0.05)。中度和重度活动期UC患者的PTL计数较缓解期UC患

者及健康对照者均明显升高(P<0.05)，轻度活动期UC患者的PTL计数较健康对照者明显升高但与缓解期UC患者相比差异无统计学意义(P>0.05)。进一步分析不同临床分期UC患者的PDW发现，轻度、中度和重度活动期UC患者的PDW水平均明显低于缓解期UC患者及健康对照者(P<0.05，见表1)。

表1 不同临床分期UC患者及健康对照者血清炎性活动指标比较Tab 1 Comparison of UC patients and healthy controls in serum inflammatory biomarkers

注：与UC缓解期比较，*P<0.05；与健康对照者比较，#P<0.05。

2.2不同临床分期UC患者及健康对照者外周血Treg细胞的表达情况中度和重度活动期UC患者的Treg细胞占CD4+T细胞比例较缓解期UC患者及健康对照者显著降低(P<0.05，见表2、图1)。

表2 不同临床分期UC患者及健康对照者外周血Th17/Treg细胞比较Tab 2 Comparison of Treg and Th17 cells in peripheral blood between healthy controls and UC patients 比例/%

注：与UC缓解期比较，*P<0.05；与健康对照者比较，#P<0.05。

2.3不同临床分期UC患者及健康对照者外周血Th17细胞的表达情况对本研究中12例UC患者(活动期8例，缓解期4例)及4名健康对照者进行Th17细胞检测，发现活动期UC患者Th17细胞比例显著高于缓解期UC患者及对照者(P<0.05，见表2、图2)。

2.4Treg细胞变化与血清炎性活动指标及Mayo评分的相关性分析对UC患者的Treg细胞比例与MPV进行Pearson相关分析，发现两者呈正相关(r=0.443,P=0.013)。对UC患者的Treg细胞比例与ESR、CRP、PLT、PDW水平和Mayo评分进行Spearman相关分析，发现UC患者的Treg细胞比例与ESR、CRP、PLT水平及Mayo评分呈负相关；与PDW水平呈正相关(见表3)。

2.5活动期和缓解期UC患者血清IL-17、IL-10和TGF-β表达水平的改变与缓解期UC患者及健康对照者相比，活动期UC患者血清中IL-17含量明显升高，而IL-10和TGF-β的含量明显降低(P<0.05，见图3)。

图1 不同临床分期UC患者及健康对照者外周血Treg细胞比例流式细胞图 A：轻度活动期；B：中度活动期；C：重度活动期；D：缓解期；E：健康对照者Fig 1 CD4+, CD25+, FOXP3+, and Treg cells in human peripheral blood between UC patients and healthy controlsA: mild UC group; B: moderate UC group; C: severe UC group; D: inactive UC group; E: healthy controls

图2 不同临床分期UC患者外周血Th17细胞比例流式细胞图 A：活动期；B：缓解期；C：健康对照者Fig 2 CD3+, CD8-, IL-17+, and Th17 cells in human peripheral blood between UC patients and control group A: active UC group; B: inactive UC group; C: heathy controls

血清炎性活动指标Treg细胞比例r值P值ESR-0.6410.001 CRP-0.8310.000 PLT-0.5640.001 MPV0.4430.013 PDW0.4090.022Mayo评分-0.7460.000

3 讨论

免疫因素在UC发病中作用一直是研究的热点[3]。传统观念认为，UC患者肠道黏膜炎症主要以IL-4和IL-13促进分化的Th2细胞为主。Th17和Treg细胞的发现拓宽了人们对IBD形成机制的认识[14]。Th17主要合成IL-17等炎性细胞因子，Th17及其效应因子IL-17在IBD发病机制中发挥重要作用，通过增强细胞的通透性、促进炎性细胞募集并活化，从而引起机体的炎性改变[15]。课题组前期研究[16]发现，在克罗恩病患者中存在Th17/Treg细胞比例失衡，可能与肠道炎症相关。EASTAFF-LEUNG等[17]也发现，与正常对照者相比，IBD患者不仅外周血中Th17细胞比例显著升高，而且肠黏膜中IL-17 mRNA表达也明显升高，提示Th17比例增加或功能亢进可能是导致IBD发病的原因之一。Treg细胞是一种具有免疫负调控作用的T淋巴细胞[18]，研究[19]发现，Treg细胞在IBD中具有抑制作用，一方面Treg可以直接杀伤CD4+T细胞、CD8+T细胞和抗原递呈细胞；另一方面Treg细胞可通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子及表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)等分子发挥抑制免疫的功能。研究[20]发现，IL-10可抑制某些炎症因子如IFN-γ、TNF-α及IL-12的分泌，在临床治疗中给予IL-10，能改善IBD患者的症状[21]。本研究发现，中度和重度活动期UC患者的Treg细胞占CD4+细胞比例较缓解期UC患者及健康对照者显著降低，活动期UC患者外周血Th17细胞比例明显高于缓解期UC患者及健康对照者，与缓解期UC患者及健康对照者相比，活动期UC患者血清中IL-17含量明显升高，而IL-10和TGF-β的含量明显降低，该结果与GENG等[22-23]的结果一致。表明Th17/Treg失衡与UC肠道炎症活动密切相关。

注：与UC缓解期比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

关于PLT相关指标与疾病活动期的关系，张星星等[24]研究认为，PLT计数可作为判断轻度以上UC严重程度的一项参考指标；也有研究[25-26]表明，与缓解期UC患者相比，MPV、PDW在轻度、中度及重度活动期UC患者均显著降低，提示MPV可作为判断UC活动性的指标；与本研究结果均一致。MPV降低与产血小板巨核细胞容积变小，或与血小板颗粒内容物增加及血小板增多、活化有关[25]。

综上所述，活动性UC患者的Th17细胞比例增加，Treg细胞比例降低，且其与UC炎性活动指标ESR、CRP、PLT水平及Mayo评分呈负相关，与MPV和PDW呈正相关，表明Th17/Treg失衡与UC疾病活动及炎症程度密切相关，其在UC发生、发展中的具体机制有待进一步研究。