彗星实验在不明原因复发性流产中对精子DNA完整性的研究

覃太洲 徐克惠 刘 莉 许文明 李福平

1.四川省成都市妇女儿童中心医院(610031)；2.四川大学华西第二医院；3.四川大学-香港中文大学生殖医学联合实验室

目前临床上对于复发性流产(RSA)病因的研究多集中在胚胎和母体因素的探讨，然而即使排除以上因素，仍有约50%RSA患者病因不明，称为不明原因复发性流产(URSA)，传统的男性精液检查是精液常规分析，这种检测结果波动较大，且其相关指标与胚胎发育和流产的关系尚不确切。精子DNA完整性检测具有较好的稳定性及较低的生物变异度，对于男性生育能力的评估，其敏感度要优于精液常规分析[1-2]。现有研究表明：精子DNA损伤会降低精子的受精能力与胚胎的发育潜能，从而降低临床妊娠率和增高自然流产率[3]。国外研究发现：当精子DNA碎片指数(DFI)>30%时，精子染色体的非整倍体率明显升高，自然受孕率很低，有时即使能受孕发育成胚胎，但大部分都在妊娠早期发生自然流产[3-4]。现已有大量研究表明了精子DNA损伤与排除女方因素的URSA的相关性[5-9]。并且精子DNA完整性检测与精液常规参数的相关性不大，很可能是一项独立的精子质量评价指标[5,8,10-11]。然而目前多数研究所采用的方法只能检测精子DNA损伤的总体比例，无法区分DNA的单、双链损伤。而不同损伤类型可能跟不同疾病的发生有一定关系，了解损伤的类型对于如何进行修复也有很大的帮助。本次研究同时使用中性和碱性彗星实验来检测精子DNA完整性与损伤类型，对精子DNA完整性与URSA的相关性进行探讨，并进一步明确精子DNA损伤的类型与URSA的关系，为临床可能的治疗方法提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2014年6月—2014年12月在四川大学华西第二医院妇产科就诊的URSA女性的配偶作为流产组。纳入标准：男女双方外周血染色体G显带正常且无家族遗传病史；非近亲结婚；女方年龄<35岁；排除严重全身性疾病；女方无甲亢、甲减、多囊卵巢综合征、高泌乳素血症、黄体功能不全、糖尿病等内分泌异常；女方无子宫发育畸形或宫腔内异常；女方抗磷脂抗体阴性；女方孕期无TORCH或其他生殖道感染，孕期无特殊药物、毒物、放射线接触史。同时收集有正常生育史的男性作为生育组。入组标准：年龄20～45岁；近18个月内有正常致孕史，且配偶无妊娠3个月内流产；无严重全身性疾病、传染性疾病和精神病；家族中无不育患者；排除泌尿生殖道感染和肿瘤病史，无生殖道发育缺陷、畸形及相应手术史。

1.2 精液标本采集及分析

按WHO推荐方法[12]采集精液,精液常规分析和DNA完整性分析均取用同一份精液样本。采用清华同方精子、微生物动(静)态图像检测分析系统(CASAS-QH-III)进行精子常规参数分析，具体工作由四川大学华西第二医院精子库实验室完成。主要检测指标包括精子浓度、总活力、前向运动、正常形态精子百分率。其参考值参照参考文献[12]。精液正常标准：精子浓度≥15×106/ml；总活力[前向运动(PR)+非前向运动(NP)]≥40%；前向运动(PR)≥32%；正常形态精子百分率≥4%。

1.3 精子DNA完整性检测

采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)即彗星实验检测精子DNA完整性。具体操作步骤参考美国TREVIGEN公司彗星实验试剂盒提供的CometAssay操作手册。本研究分别使用中性和碱性彗星实验，以区分DNA的单、双链损伤。

1.3.1诱导单链DNA损伤(SSB)[13]用磷酸缓冲液(PBS)将1份生育组样本精子密度稀释至1×106/ml。将稀释后标本分成3份，每份300 μl，2份分别加入0.1%和0.3%的H2O2100 μl在室温中孵育20 min，另外1份作阴性对照。后续步骤按彗星实验的操作步骤进行。

1.3.2诱导双链DNA损伤(DSB)[13]用PBS将1份生育组样本精子密度稀释至1×106/ml。浸入裂解液1 h后，浸入TBE中20 min。取出玻片后，用50μl 1×Buffer Tango孵育10 min。再将15μl 1×Buffer Tango混合15 U 限制性内切酶Alu I覆盖于载玻片上，盖上盖玻片，在37℃培养箱中分别孵育20和40 min。同时做阴性对照。用TBE浸泡10 min。后续步骤按彗星实验的操作步骤进行。

1.4 彗星图像分析软件

采用CASP 1.2.3 beta2彗星图像分析软件。判断精子DNA损伤程度[14-15]：①核荧光完整、强度高，彗星尾长<10 μm，为无损伤；②核荧光完整、强度较低，10 μm<彗星尾长<40 μm，为轻度损伤；③核荧光不完整、强度低或与彗尾不能明显区分，彗星尾长>40 μm，为重度损伤。每份样本计数500个精子。

1.5 统计学方法

全部数据录入Excel表格，采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料用例数、百分率表示，经H2O2或AluI诱导精子DNA损伤类型的相关性分析采用Spearman秩相关分析。流产组与生育组的精液常规参数和精子DNA碎片化指数(DFI)的比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1基本情况

本次研究，流产组纳入50例男性，年龄(29.6±4.6)岁(23～44岁)；生育组纳入50例男性，年龄(30.5±4.9)岁(21～39岁)。

2.2 彗星图像

本研究中，中性电泳检测出的DNA双链损伤(DSB)彗尾位于X轴，碱性电泳检测出的DNA单链损伤(SSB)彗尾位于Y轴。具体分类见图1。

A无损伤：核荧光完整、强度高，彗星尾长不超过10 μm；B轻度DSB：核荧光完整、强度低，彗尾位于X轴，10 μm<尾长<40 μm；C重度DSB：核荧光不完整、强度低或与彗尾不能明显区分，彗尾位于X轴，尾长>40 μm；D轻度SSB：核荧光完整、强度低，彗尾位于Y轴，10 μm<尾长<40 μm；E重度SSB：核荧光不完整、强度低或与彗尾不能明显区分，彗尾位于Y轴，尾长>40 μm图1 精子DNA损伤的类型(10×20)

2.3 经处理后精子的彗星实验

样本经H2O2处理后，精子DNA SSB明显增多，H2O2作用的浓度越高，其单链DNA碎片指数(SSB-DFI)也越高，两者正相关(r=0.702，P<0.001)。经Alu I处理后，精子DNA DSB明显增多，Alu I作用的时间越久，其双链DNA的DSB-DFI也越高，两者正相关(r=0.593，P<0.001)。见表1，图2，3。

2.4 精液常规参数

精液常规参数对比，流产组的精子浓度[(91.0±56.8)×106/ml]低于生育组[(121.1±50.4)×106/ml](P<0.05)。两组的前向运动[(52.5±13.5)%，(54.3±10.8)%]、总活力[(58.9±12.7)%，(61.3±10.5)%]、正常形态精子百分率[(3.4±2.6)%，(3.3±2.2)%]差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5 精子DNA完整性

精子DNA完整性对比，流产组拥有更高的精子DNA DFI[(29.5±4.3)%]和精子SSB-DFI[(19.0±3.8)%],与生育组[(18.2±3.5)%，(8.9±3.0)%]差异有统计学意义(P<0.05)。然而，两者的精子DSB-DFI[(10.5±3.4)%，(9.2±2.4)%]差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同处理后的精子碱性和中性彗星实验结果比较(例)

A:经不同浓度H2O2处理后DSB-DFI和SSB-DFI的对比；B:经不同作用时间AluI处理后DSB-DFI和SSB-DFI的对比图2 经H2O2或AluI处理后的DNA碎片化指数

A：未经处理的DSB；B：用Alu I处理20 min后的DSB；C：用AluI处理40 min后的DSB；D:未经处理的SSB；E：用0.1% H2O2处理后的SSB；F：用0.3% H2O2处理后的SSB图3 经H2O2或Alu I处理后的彗星图像

3 讨论

目前，用于精子DNA完整性检测的技术较多，常用的有精子染色质结构分析法(SCSA)；精子染色质扩散试验(SCD)；DNA断裂荧光原位杂交技术(DBD-FISH)；末端转移酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL)；8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)测定法等。但这些方法都有一个共同的缺点，那就是无法区分DNA损伤类型。本研究采用的彗星实验可根据电泳液酸碱性的不同将DNA单、双链损伤区分开来，从而进一步探寻精子DNA损伤类型与URSA的关系。

本研究中，精液常规参数对比，流产组的精子浓度明显低于生育组，而前向运动、总活力、正常形态精子百分率差异均无统计学意义。国内张丽红等[16]对85例RSA患者配偶和50例正常生育男性的精液常规分析结果显示，两组的精子浓度、前向运动、正常形态精子百分率两组未见差异。国外Simon等[8]的研究也得出类似的结论。以上研究提示精子浓度可能与URSA有一定联系，但由于精液常规参数波动范围大，并不能准确提示URSA的病因。

关于精子DNA完整性对比，流产组拥有更高的精子DNA碎片指数。这与之前的大部分研究结果相吻合[5-9]。精子DNA损伤过多会降低精子的受精能力与胚胎的发育潜能，从而降低临床妊娠率和增高自然流产率。同时值得注意的是在对精子DNA损伤类型的区分中，流产组的精子单链DNA损伤率明显高于生育组。而两者的精子双链DNA损伤率差异无统计学意义。这进一步提示精子DNA的单链损伤可能是造成流产的重要因素之一。本研究与Ribas-Maynou等[17]2012年的研究结果不一致，他认为过高的DSB造成了流产，而过高的SSB会导致不育，但该研究仅纳入了20例RSA患者，样本量较小。

DNA的单链损伤与氧化应激有关，而双链损伤更多与内源性核酸酶有关[18-20]。这也是本研究中使用H2O2诱导SSB，AluI诱导DSB进行对照的原因。已有很多研究证实了活性氧类物质(ROS)与RSA的关系，Shamsi等[21]对25例排除女性因素的RSA患者的配偶精液中ROS水平进行检测，发现其平均值是正常生育组的9倍以上。Gil-Villa等[22]对23例RSA患者配偶精液的研究发现，与正常生育组相比，RSA组精液中脂质过氧化水平更高，同时精浆的抗氧化能力也更弱。过量ROS或者机体抗氧化能力不足时，可直接氧化精子DNA碱基或发生脂质过氧化反应，造成基因突变、易位、缺失，DNA单链断裂[18]。如果大量的DNA单链损伤在卵裂期未能被完全修复，这可能导致胚胎染色体异常，从而发生流产[23]。

本研究还发现精子DNA的完整性比传统的精液常规参数更能解释URSA中男性所占的因素。曾有观点[24]认为精子形态学异常比例过高可能是导致URSA的原因。但本研究未发现流产组与生育组的正常形态精子百分率有统计学差异。国内岳焕勋等[25]对185例URSA患者配偶的精液进行形态学分析发现，发生URSA的患者精子畸形率并未高于正常生育者。国外Kahraman等[26]应用FISH技术发现导致自然流产的胚胎染色体异常可能是来源于精子的染色体异常。Templado等[27]研究发现，精子形态学异常与精子染色体异常未表现出关联性。而国内徐秀民等[28]已证实，精子染色体非整倍体率与精子DNA损伤率呈显著正相关。这都表明精子DNA的完整性与URSA可能有关联，其比精子常规参数更能预测妊娠的结局。

目前，对于URSA，临床上还没有确切有效的治疗方法。和本研究结果一样，许多研究都已表明URSA患者的配偶精子DNA完整性与正常生育组有明显差异。而辅助生殖技术中的精子体外优选技术可以改善精子活力与形态，特别是上游法还可以回收DNA完整性较好的精子[29]。因此，可以尝试对精子进行上游法优选后，再行宫腔内人工授精(IUI)来治疗URSA。国内张洲等[30]运用此法对33例URSA患者治疗了79个周期，其中临床妊娠14例，足月产12例，早产1例，流产1例。初步结果提示该治疗方法可能有一定效果。本研究还发现精子DNA的单链损伤可能是造成流产的重要因素之一，而氧化应激损伤又是导致DNA单链损伤的主要原因[18]，所以抗氧化治疗可能对治疗URSA有一定帮助。Gil-Villa等[31]选取了17例URSA患者的配偶，其中有9例被检测出精子DNA损伤增加和脂质过氧化，对他们进行至少3个月的抗氧化药物治疗后，有6例获得了成功的妊娠。

本研究应用彗星实验技术初步探寻了精子DNA损伤及不同的损伤类型与URSA的关系，并为临床寻找可能的治疗方法提供了新的思路。但由于病例数的限制，未来还有待更多样本的检验。精子DNA完整性对于精液质量的评价、男性生育能力的评估和妊娠结局的预测能力似乎都要优于精液常规分析。彗星实验技术由于能够区分DNA损伤类型，被证明是一个有意义的临床辅助诊断工具。由于彗星实验操作的复杂性，熟练的实验人员、稳定的实验室环境以及更为敏感智能的图像采集分析系统是提高结果准确性的关键。