京海黄鸡Smad3基因多态性与生长性状的相关性研究

2018-08-20陈福祥路钦越郭艳丽莫魁霞吴鹏飞张跟喜王金玉

中国畜牧杂志 2018年8期

陈福祥，路钦越，陈兰，郭艳丽，莫魁霞，吴鹏飞，张跟喜，王金玉

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）

Smad蛋白（Drosophila Mothers Against Decapentaplegic Protein）家族是把转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β， TGF-β）与其受体结合后产生的信号从细胞质传导到细胞核内的信号分子，且不同的Smad介导不同的TGF-β家族的信号转导[1]。目前为止，已有8种Smad成员被报道，分别是Smad1～Smad8。按照结构和功能将Smad家族分为限制型Smads（R-Smad）、共有型 Smads（Co-Smad）和抑制型Smads（I-Smad）3类[2]。Smad3属于限制型 Smads，是TGF-β诱导生长中重要的介导因子。Smad3对细胞生长作用是双向的，既有促进，又有抑制，具体机制目前尚未完全清楚。Verrecchia等[3]研究表明，Smad3是抑制细胞和组织纤维化的关键基因。鸡的Smad3基因位于10号染色体，基因总长度为60 196 bp，由9个外显子组成。Smad3基因翻译可产生2种功能的蛋白质，一种mRNA（NM_204475.1）全长1 280 bp，编码426个氨基酸残基，另一种mRNA（XM_015292068.1）全长1 201 bp，编码321个氨基酸残基。刘育林[4]使用电子克隆方法预测并通过分子生物手段克隆了鸡Smad3的cDNA，发现鸡Smad3在各种组织中广泛表达，在鸡骨骼肌发育过程中Smad3表达下调。关于Smad3基因对鸡经济性状的影响，仅检索到魏岳[5]的一篇报道，其研究发现边鸡Smad3基因外显子8处的1个突变与MSTN基因G2283A位点的基因型组合对生长和屠体性状有显著或极显著的影响。

本研究采用PCR-SSCP技术检测到京海黄鸡Smad3基因第6、7外显子的多态性，并结合生长性状进行相关分析，旨在探讨Smad3基因作为京海黄鸡生长性状遗传标记的可能性，为京海黄鸡生长性状标记辅助选择提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料 349只饲养条件相同的京海黄鸡来自江苏京海禽业集团有限公司，记录京海黄鸡初生重和2、4、6、8、10、12、14、16周龄体重。翅静脉采集血样1.5 mL，肝素钠抗凝，-20℃保存。采用常规酚-氯仿抽提法提取DNA，用分光光度计（NanoDrop 1000，Thermo Fisher）测定基因组DNA的OD值，记录后放置在-20℃冰箱备用。

1.2 引物设计和PCR扩增根据GenBank已发表的鸡Smad3基因序列（NC_006097.4），采用Primer5.0针对Smad3基因的外显子6和外显子7分别设计1对引物。引物序列信息见表1。

PCR反应体系为20 μL：上、下游引物各0.8 μL（10 µmol/L）；2×Taq Master Mix for PAGE （Dye plus）10 μL；超纯水 7.4 μL；DNA 模板 1 μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，用56℃退火30 s（PCR梯度试验获得P1和P2最佳退火温度均为56℃），72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3 PCR-SSCP分析和DNA测序 2.5 μL PCR产物和7 μL变性剂混合后98℃变性10 min，迅速放置冰盒上，在-20℃冰箱里放置6 min，使温度迅速下降。加5 μL变性产物（在冰盒上操作）在30%的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶双丙烯酰胺=29:1）孔中。首先在250 V电压下电泳10 min，待条带明显分层后用120 V电压跑14 h（P2的产物跑15 h）。电泳结束后，进行银染显色并用紫外凝胶成像系统照相分析。不同基因型挑选3个个体送上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.4 统计分析将不同基因型个体分类并统计数目，计算基因型频率和基因频率以及杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）。配合下列模型进行最小二乘法分析，比较京海黄鸡的生长性状在Smad3不同基因型间的差异：

模型中，yij为性状的测定值；μ为群体平均值；Gi为基因型效应；eij为随机残差。统计分析采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物的检测结果利用所设计的引物分别对Smad3基因进行PCR扩增，产物用30%的变性聚丙烯酰胺凝胶（29:1）电泳检测，通过DL500 DNA Marker（Sangon Biotech）比对发现P1引物片段出现在250 bp左右的位置，P2引物片段出现在200 bp左右的位置，与目的片段一致，而且条带清晰，特异性好，可用于SSCP分析。

2.2 Smad3基因PCR-SSCP分析及测序结果 Smad3基因的PCR产物经过SSCP分析后，发现第6外显子和第7外显子分别出现不同的基因型，第6外显子2种基因型分别命名AA和AB（图1），第7外显子3种不同的基因型分别命名为TT、TM和MM（图2）。不同基因型的PCR产物的DNA测序结果显示，Smad3基因第6外显子上的第53424碱基发生T→C的突变（图3），命为g.T＞C53424；Smad3基因第7外显子上的第54959碱基发生C→G突变（图4），命为g.C＞G54959。2.3 Smad3基因多态性数据分析由表2可见，对于Smad3基因来说，不论是第6外显子还是第7外显子，均表现为杂合型个体所占的比重最高，纯合型所占的比重小，AB和TM是优势基因型，A和T是优势基因，g.T＞C53424位点和g.C＞G54959均属于中度多态，遗传差异较大。

图1 基因型AA和AB条带

图2 基因型TT、TM和MM条带

2.4 Smad3基因与体重的相关分析由表3可知，在京海黄鸡2～16周龄阶段，基因型AB个体体重均大于AA个体，且8周龄时差异显著（P＜0.05），所以杂合子是生长性状的优势基因型。对于外显子7处的突变，TT、TM和MM 3种基因型从初生重到16周龄的体重差异均不显著（P＞0.05），TT基因型的体重最小。

表1 引物序列信息

图3 AA和AB基因型序列比对

图4 TT、TM和MM 3种基因型序列比对

3 讨论

关于Smad3基因的功能已有一定的研究报道。王运涛等[6]研究发现，野生型Smad3基因抑制间充质干细胞（MSC）增殖，并通过非细胞外信号调节激酶（ERK）通路促进MSC向成骨分化和成熟。阮井玲[7]研究发现，Smad3基因通过正向调节抑制素基因GDF-8，负向调节生肌调节因子MyoD基因，表明Smad3基因对猪肌肉生长有一定的调控作用。Shi等[8]检测到的4个SNP位点与中国牛Smad3基因表达及生长性状显著相关。以上研究结果表明，Smad3基因对不同物种的生长性状具有影响。当前Smad3基因多态性的研究主要集中在人上，如Zhang等[9]研究发现，Smad3基因可能与膝关节炎发育有关；Turner等[10]通过全基因组关联研究发现1个单核苷酸多态性与增强子活性和Smad3基因表达相关，会改变人动脉平滑肌的增殖；Wang等[11]研究Smad3在甲状腺乳头状癌遗传易感性中的作用时发现1个25 kb的单倍型，单核苷酸多态性丰富，可为甲状腺癌的前期诊断提供依据。

魏岳[5]报道，边鸡Smad3基因外显子8处的1个突变与MSTN基因G2283A位点的基因型组合对生长和屠体性状有显著或极显著的影响。本实验以Smad3基因作为影响京海黄鸡生长性状的的候选基因，在第6、7外显子共检测到 2处突变（g.T＞C53424和g.C＞G54959），PIC分别是0.315和0.349，都属于中度多态，说明所选群体遗传变异较大。这2处突变均未导致编码氨基酸的改变，为同义突变。关联分析显示，g.T＞C53424位点仅对京海黄鸡的8周龄体重有显著影响，而g.C＞G54959位点对京海黄鸡各周龄体重影响都不显著，说明这2个位点不是影响京海黄鸡生长性状重要位点。本研究发现的突变位点对京海黄鸡繁殖性状以及其他鸡品种重要经济性状的遗传效应有待进一步研究。