非编码RNA作用机制及其在动物育种中的应用

张 禹，李丽娟，钟佳琳，雷初朝，陈 宏，黄永震*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.贵州工程应用技术学院毕节试验区研究院，贵州毕节 551700）

Altman和Cech发现了RNA的“酶”作用，为人类探索生命的奥密打开了一扇新的大门。Cech[1]用原始RNA世界、当代RNA世界、RNA技术和生物医学应用的世界概括了RNA领域的发展及未来。在这3个RNA世界当中，非编码RNA（Non-coding RNA，ncRNA），即那些目前大家认为不作为蛋白翻译模板（mRNA）的各种RNA，在基因的表达调控中起着至关重要的作用，对于动物的育种工作具有指导意义。

1 ncRNA在基因表达中的调控作用

调控基因表达是ncRNA的一个核心功能。例如，在X染色体失活过程中，Xist（An Essential lnc RNA for X Chromosome Inactivation）与 XCI（X-chromosome Inactivation）位点相互作用，引起该染色体构象变化，更加容易与各种蛋白因子相结合，最终导致X染色体失活[2-3]。近年来研究人员对ncRNA做了大量研究，其中，以非编码长链RNA（lncRNA）、miRNA和环状RNA（circRNA）的研究为主。同时，研究还发现相当数目的ncRNA调控转录都是通过别位作用（Trans Effect）完成的，即调控离此ncRNA转录产生处距离较远位点的基因表达或染色质表观遗传状态。

1.1 miRNA对基因表达的调控 之前大多数研究认为，miRNA在细胞浆中通过结合靶基因3´UTR抑制或降解mRNA，从而导致翻译的终止或抑制，最终造成相应功能的障碍，以此机制来发挥负调控作用[4]。但也发现部分miRNA所在基因组的位置与一些增强子区域重叠，于是便引出了miRNA与增强子有何关系的疑问，并成功通过后来的一些研究证明了miRNA是一种双功能分子[5]。当miRNA位于细胞核中时，通过结合增强子改变其染色质状态激活表达；而在胞浆中时，则可通过作用于mRNA 3´UTR区域阻断翻译（图1）[5]。研究人员把定位于核内并具有激活作用的RNA称为NamiRNA（Nuclear Activating miRNA）。基于此，提出了NamiRNA-增强子靶基因网络激活模型[5]，用于揭示miRNA在细胞核内的功能，并可借此模型解释一些表达上调现象，如肿瘤细胞中的“上调基因”。

图1 miRNA在胞浆与胞核中的双向性功能[5]

1.2 lncRNA对基因表达的调控 lncRNAs虽然很久以前就被发现，但直到近年才逐渐被关注。lncRNAs对于基因的表达调控渗透在基因表达的每一个阶段：表观遗传水平调控、转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控[6]。在表观遗传水平，主要通过介导组蛋白修饰与甲基化来改变染色质表观状态，从而影响基因的正常表达。如HOTAIR可以通过对蛋白PRC2、LSD1、CoR-RESTREST的招募，完成对于人类HoxD基因表达的调控[7]。在基因的转录过程中，一些lncRNA可通过干扰转录因子与启动子的结合干扰转录。如DHFR上游的1个lncRNA能与DHFR启动子形成RNA-DNA螺旋结构，抑制转录因子TFIID的结合，从而抑制DHFR基因表达[8]。在转录完成后，lncRNA可与miRNA相互作用参与转录后的调控、可作为小RNA的前体、调控mRNA的选择性剪接、影响mRNA稳定性。如NLC1-C也称为基因间RNA162（LINC00162），在细胞核中可抑制miR-320a和miR-383的转录，进而成功地对人类精子发生进行调节[9]。在mRNA翻译阶段，lncRNA可在翻译起始及延伸阶段进行调控改变蛋白活性，或与特定蛋白结合，改变其在胞质中的定位[10]。

1.3 circRNA对基因表达的调控 circRNA作为ncRNA，广泛存在于生物细胞内，且占据了约所有转录本的10%[11]。然而，由于技术限制，早在1976年植物中就发现了的circRNA，在被验证之前，一直被认为是mRNA合成过程中错误剪接的产物。直到2012年被证实，circRNA稳定且广泛地存在于包括人类在内的真核生物界[12]。至此，circRNA的存在再次引起了研究者的广泛重视。已发现的circRNA的主要作用是调节基因表达，具体机制主要包括以下3种[13]。

1.3.1 miRNA分子海绵作用 一些circRNA上具有miRNA结合位点，能够竞争性结合miRNA，从而抑制其对相应mRNA的降解作用，主要见于外显子构成的circRNA（如CDR1as、circRNA-SRY以及circRNA-ZNF19等）。哈佛医学院Salmena等[14]的ceRNA调控假说在2011年7月做出了合理推断。ceRNA具有数量和种类不等的MRE（miRNA应答元件，miRNA Response Element），可竞争性结合miRNA，降低miRNA对靶基因的负性调控。在李强等[15]对circRNA的miRNA海绵功能的检测实验中，以人胚胎细胞HEK293T、人工合成的has_circ_0000254的全长序列和突变序列、miR-125b、inhibitor及Mir-NC和Trans1 T1 感受态细胞为材料，采用双荧光素酶报告基因法进行实验，结果显示miR-125b能通过结合hsa-circ-000254影响荧光素酶报告载 体 psiCHECK2-has_circ_0000254（C254） 荧 光 活性改变，miR-125b inhibitor能封闭miR-125b与hsacirc-000254结合影响其荧光活性改变。

1.3.2 调控经典的RNA剪接 以MBL的表达为例[16]。circMbl是muscleblind基因的第2个外显子形成的circRNA。muscleblind基因编码剪接因子MBL（甘露糖结合凝集素），与mRNA的稳定性密切相关。circMbl的侧翼内含子上具有很多MBL蛋白结合位点，可以特异性结合MBL蛋白，二者的结合促进circMbl的产生，而circMbl的产生则进一步结合MBL蛋白促进circMbl的产生。circRNA是通过转录产生的，经典的mRNA剪接与外显子的环化作用是相互竞争的，因此经典的mRNA剪接就会被竞争性的抑制，即muscleblind基因相关mRNA的剪接会因此而受到抑制。

1.3.3 与转录调控原件结合调控母基因的转录 有研究显示，有些circRNA分子可以通过吸附蛋白质因子，影响蛋白功能从而参与到基因的表达调控中[17]。如ciankrd52可与RNA聚合酶复合体相互作用，从而影响该酶的活性，最终达到调节转录的作用。Li等[18]研究发现，ElciRNA（如circPAIP2）能够与U1互补配对，进而与U1小核核糖核蛋白（U1small Nuclear Ribonucleoproteins，snRNP）相互作用，从而顺式调控作用促进自身编码基因转录。

2 ncRNA对于动物育种的重要意义

2.1 ncRNA对于动物育种的重要作用

2.1.1 ncRNA对繁殖的影响 许多研究表明，miRNA在卵泡的生长发育过程中发挥着重要作用[19]。Tesfaye等[20]通过研究体外成熟与未成熟牛卵母细胞发现了59种miRNA的差异表达，其中，31个miRNA优先在未成熟牛卵母细胞中表达，28个优先在成熟牛卵母细胞表达。有研究发现，通过人为干扰降低miRNA会导致卵母细胞发育受阻，降低排卵率，对雌性生殖造成影响[21]。

lncRNA在哺乳动物精子的生长发育过程中有着重要的作用[22]。HongrES2是一个长1 588 bp的lncRNA，特异性地在附睾尾部区域表达，该转录物优选位于细胞核中，在细胞核中它被加工成23bp miRNA类小RNA，称为mil-HongrES2，其抑制附睾特异性蛋白CES7的表达，从而抑制其胆固醇酯酶活性，调节精子的成熟[23]。

由此可见，ncRNA在动物生殖细胞生长发育过程中具有一定的调控作用。目前，关于各类家畜有关繁殖性能的基因已经有相当多的研究，并且，自2002年lncRNA正式被提出到2010年报道lncRNA可调控细胞重编程，再到Weikard等[24]利用RNA深度测序，发现牛皮肤组织中存在4 848个潜在的长链非编码RNA，再到Yue等[25]发现lncYYW在成肌细胞分化过程中上调表达，过表达lnc YYW能增加细胞周期中S期的细胞数目，不难发现目前关于ncRNA对基因表达调控的研究也在快速发展。若能将ncRNA作为调控相关基因的重要工具，在原有的分子标记辅助选择（MAS）基础上加入ncRNA对于基因表达调控的内容，将会对品种改良与新品种的培育有很大帮助。

2.1.2 ncRNA对胚胎发育的影响 近些年的研究表明，ncRNA在胚胎发育的各个时期都发挥着重要作用。Dicer酶突变的斑马鱼的卵母细胞和受精卵在胚胎发育过程中出现了严重缺陷但可通过体外注射成熟miRNA恢复正常的实验表明，miRNA对于胚胎发育具有重要作用[26-28]。在ncRNA对早期胚胎发育影响的研究中，Elmira等[29]在非洲爪蟾胚胎上通过使用HTSeq根据Tophat将转录表达转换为了RPKM值，并通过高斯过程模拟了表达。在众多lncRNA中发现了8个lncRNA可能对早期胚胎的发育具有调控作用。同时，有研究表明，HOTAIR通过反式作用调控在动物胚胎早期发育中对细胞的分化至关重要的Hox基因的表达[30]。在关于胚胎后期发育的相关研究中，Boris等[31]对胎盘中基因端粒较长做出了解释，胎盘中的低甲基化有利于lncRNA TERRA的表达，而在癌细胞的研究中发现TERRA可以通过与端粒酶的结合抑制端粒酶的作用，因此胎盘中的端粒酶因受高表达的TERRA的抑制而降低了对胎盘中基因端粒的损伤，造成胎盘中端粒较长的现象。Zhang等[32]使用短干扰RNA对As-api5表达的下调导致A.sinica的死亡率和胚胎畸形增加。其实验结果表明，API5在胚胎滞育终止和早期胚胎发育中起关键作用。miRNA在胚胎干细胞增殖与自我更新方面也具有重要的作用，小鼠miR-290-295（人miR-371-373家族）在其中高度表达，而在其他组织表达下调，且有研究阐明了一个新的ESC的维持和增殖中β-catenin/LEF1-miR-372和miR-DKK1正反馈调节循环[33]。可见，ncRNA的调控作用存在于动物从胚胎发育到胎儿诞生的各个时期，并且一些ncRNA对于某些在胚胎发育过程中发挥着重要作用的基因具有调控作用。

2.1.3 ncRNA对表观遗传的影响 ncRNA存在并在体细胞和生殖细胞中起作用。体细胞中的ncRNA变化导致mRNA转录组改变，而种系ncRNA可能介导表观遗传记忆的传播。在受精过程中，精子与卵子在结合时都携带了部分RNA（mRNA与ncRNA）。Carrell等[34]通过表观遗传记忆的研究发现，环境导致的表观特征会通过雄性精子遗传给后代，ncRNA可能是DNA序列与其最终表观遗传状态之间的连接。Bony等[35]在分析由类视黄醇诱导的鼠类ES细胞中Hox簇的转录和表观遗传学特征的动态变化中发现，来自Hox簇的2条ncRNA可代表ES细胞中快速诱导产生的转录物，并且它们与动态表观遗传学变化相关。该团队解释了Hox B簇中的ncRNA（Hobbit1）和Hox编码基因的共调节是由共享的RARE依赖性增强子介导的。ncRNA可以通过影响基因组的表观遗传修饰来直接作用于表观遗传学水平，或者通过控制表观遗传调节剂的表达，从而间接诱导表观遗传改变。

自克隆羊“多利”诞生以来，克隆技术在各国快速发展起来，虽然在人类方面涉及伦理问题还有待商榷，但在动物方面可谓前景广阔。然而，在目前的克隆技术中，存在的最大问题是成功率极低。Ibtishama等[36]指出，由于各种原因导致克隆失败，包括早期和晚期堕胎、免疫系统受损、循环和呼吸问题以及高死亡率，且失败多发生于克隆体出生前，其主要原因似乎是非典型表观遗传重编程，即在受精卵最初几次卵裂中，去甲基化酶清除了DNA分子上几乎所有从亲代遗传来的甲基化标志；在胚胎植入子宫时，一种新的甲基化遍布整个基因组，甲基化酶使DNA重新建立一个新的甲基化模式[37]。而在这一过程中，许多克隆胚胎却显示总体DNA甲基化模式异常。然而，在顾永娟等[38]关于胃癌中ncRNA与DNA甲基化的关系综述中列举了大量有关ncRNA以及DNA甲基化相互调控的研究，指出启动子区域的异常甲基化可能导致miRNA的异常表达，而miRNA并不只受表观遗传机制调控，也能通过直接作用于DNMT、HDAC和组蛋白甲基转移酶（HMT）调控表观遗传修饰从而调控DNA甲基化和组蛋白修饰过程。且ncRNA可通过影响与重编程相关的基因的表达调控细胞的重编程过程[39]。ncRNA的作用与克隆的成功与否有可能具有一定的联系，在这一过程中对于ncRNA作用的研究或许有助于提高克隆技术的成功率与准确性。而克隆技术的成熟对于动物遗传育种的研究及应用将会有极大的推进作用。

2.2 ncRNA在动物育种上的探索 对于ncRNA的研究表明，ncRNA在表达上具有组织特异性，即在不同的组织中或组织的不同时期有着不同表达量的ncRNA参与细胞基因表达等生命活动。因此目前关于ncRNA对于动物生产性能的影响也大多是依据这个思路。

近期在产奶性能方面有一些新的发现。金晶等[40]以泌乳期高乳品质和低乳品质中国荷斯坦奶牛乳腺组织作为实验对象，通过高通量测序技术检测miRNA，发现了56个差异表达miRNA，并成功预测了相关功能靶基因CSN3、SCD、LALBA和DGAT2。纪志宾[41]研究表明，miR-143与IGFBP5在不同泌乳时期乳腺组织表达趋势相同，均在泌乳高峰期低表达，且发现miR-143靶向IGFBP5 3'-UTR，并正向调控其表达；miR-143延缓了乳腺上皮细胞周期进程，可抑制乳腺上皮细胞的增殖，并促进其凋亡。林先滋等[42]研究表明，FASN（脂肪酸合酶基因）与BTN1A1（嗜乳脂蛋白基因）的3'UTR上的结合位点分别有3个和2个，其中miR-103位于BTN1A1的靶位点与已知物种间同源性较高。Wang等[43]的研究表明，miR-221、miR-33b、miR-31在奶牛泌乳期高表达，而miR-223在泌乳高峰期则下降。胎衣不下奶牛母体胎盘中bta-miR-31与正常排出组奶牛相比表达量明显偏高[44]。这些研究表明，ncRNA的差异表达与奶牛的产奶相关性状的差异相关联。可以作为今后利用miRNA调控奶牛产奶性能的重要依据。miRNA在奶牛乳腺发育和泌乳机理方面的研究才刚刚起步[45]。

在肌肉调控方面，尤其是对于猪肉与牛肉的研究较多。miR-206作为在2012年以前发现唯一在骨骼肌中特异表达的miRNA，其表达异常与一些肌肉相关疾病如肌肉营养不良、肌萎缩性侧索硬化症等有关[46]。HMGCS1基因对于猪的骨骼肌发育具有一定影响，而miRNA-18a/b则可通过调控HMGCS1的表达间接影响骨骼肌的发育[47]。王亚辉等[48]通过在牛骨骼肌中做EDU增殖发现，mir-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有促进作用。在牛肌内脂肪的研究中发现，牛肌内脂肪和皮下脂肪组织确实存在一些差异表达的miRNAs[49]，根据其在相关信号通路中的富集程度可推测其作用机制，如miR-27b的预测靶基因在MAPK信号通路中富集度最高，可推测其作用机制并进行下一步研究。大量研究表明，miRNA对于骨骼肌性状或其他性能有具有调控作用。Sun等[50]研究表明，lncRNA同样可以调控这些性状，一种在成肌细胞分化过程中逐渐上调的新型肌肉特异性RNA lnc MD，其表达上调和沉默可以引起肌原性标志物——肌球蛋白重链（MHC）和肌细胞生成素（Myo G）的上调和下降。Jin等[51]发现，通过过表达或抑制lnc133b可促进卫星细胞分化的增殖或抑制；Li等[52]发现了一种脂肪细胞分化中差异表达的lncRNA并命名为脂肪细胞分化相关长链ncRNA（ADNCR），可通过作为miR-204的竞争性内源RNA（ce RNA）抑制脂肪细胞分化。以上研究表明，不仅miRNA对于动物生产性能具有调控作用，lncRNA也有，很有可能circRNA等其他ncRNA都有这方面的作用。最初认为在分子层面是表达的基因片段对性状的调控起作用，然而现在发现miRNA、lncRNA也可以。由于性状是多方面协调作用最终的结果，如未对这一体系有确切了解，在动物育种工作中将无法保证准确度与效率。

对于不同畜禽及ncRNA的作用也开展了相关研究。截止2015年,已报道的猪miRNAs仅有326个，且miRNAs调控猪脂肪发育的研究十分欠缺[53]。顾真真等[54]研究发现，lnc LER在卢氏绿壳蛋母鸡各组织中均有表达，尤其在产蛋高峰期肝脏中的表达量较高。作为lncRNA而广为人知的H19转录物（印记的母本表达转录物），被认为H19基因启动子区甲基化非常可能参与了辽宁绒山羊次级毛囊的转录抑制[55]。miR-191、miR-25-3p、SNORD44和SNORD48在怀孕和未怀孕的母牛体内均出现了差异表达[56]，可利用这一特点作为检测参考标准。谭娅等[57]通过对猪心肌与骨骼miRNA转录组的比较分析揭示了二者生理学特征不同的原因。miRNA因这一特性而成为了兽药研究领域中最有利的生物标志物的候选者[58]。

3 展 望

ncRNA因其功能特性而具有与DNA 同样重要的地位，但同时它作为基因表达过程的中间调控工具而非遗传信息本质。随着分子生物技术的不断发展，越来越多的ncRNA被发现，其功能和结构研究也越来越深入。对这些ncRNA的研究仍将是不断地发现新的ncRNA及新的ncRNA的调控机制及作用的过程。ncRNA很可能对于克隆技术的成功起着重要的作用，但仍有待研究和证明；ncRNA在畜禽遗传育种方面表现出了巨大的潜力，但国内外的研究目前都还很少，国内尤为匮乏。因此，参照基因研究过程中的基因文库，建立ncRNA 文库，可为推进ncRNA的研究及实际生产应用提供帮助。