辛伐他汀与明胶海绵对兔肩袖修复术后腱-骨愈合的影响

李肯 戚超 赵夏 于腾波

作者单位：266003 山东，青岛大学医学院附属医院运动医学科

肩袖肌腱损伤 ( rotator cuff tears，RCT ) 是造成肩关节疼痛及功能障碍最常见的疾病之一，其中冈上肌腱损伤最为多见[1]，约占肩袖损伤的 35%～38%。肩袖肌腱损伤往往须手术治疗，而手术成功的关键很大程度上取决于术后肩袖止点的腱-骨愈合情况，据统计，肩袖肌腱修复的失败率为20%～90%[2]，肩袖止点腱-骨愈合不良不但延长了治疗时间，而且还会影响患者术后肩关节的功能康复[3]。长期以来如何更好地促进肩袖腱-骨愈合，使其恢复原有的功能，一直是运动医学科医生的追求。辛伐他汀为临床上常用药，能够降低血清胆固醇水平及心脏病的发作，常用来治疗高脂血症[4-5]。有研究证明局部应用辛伐他汀能够促进前交叉韧带重建骨隧道腱-骨愈合的作用[6]，但其对于肩袖修复术后腱-骨愈合的作用，目前研究较少。本实验通过建立兔肩袖损伤模型来研究局部应用辛伐他汀对肩袖修复术后腱-骨愈合的影响。

材料与方法

一、材料和实验对象

辛伐他汀 ( 杭州默沙东制药有限公司 )、明胶海绵 ( 南京金陵制药厂 )、Instron-3300 万能材料试验机 ( 青岛大学提供 )、24 只体重 2.0～3.0 kg 的成年雄性新西兰大白兔 ( 青岛大学动物实验中心提供 )。

二、辛伐他汀 / 明胶海绵复合物的制备

将 5 mg 辛伐他汀粉末溶于 10 ml 无水乙醇中混合均匀，然后吸取 1 ml 该溶液浸入明胶海绵 ( 10 mm长，5 mm 宽，2 mm 高 ) 中，使每块明胶海绵含有0.5 mg 的辛伐他汀，自然干燥消毒后置于 4 ℃ 冰箱保存备用。

图1 a：一片约 0.8 cm × 0.5 cm 的冈上肌( SSPT )；b：将辛伐他汀 / 明胶海绵复合物( SGS ) 填塞到大结节骨槽 ( Bone trough ) 上并用5-0 Prolene 缝线穿过骨孔 ( Bone tunnels ) 以水平褥式缝合法缝合Fig.1 a: A slice of supraspinatus ( SSPT ): 0.8 cm ×0.5 cm approximately; b: The complex of simvastatin /gelatin sponge ( SGS ) was stuffed into the bone trough the large tuberosity of the humerus and the supraspinatus was sutured through the bone tunnels with 5-0 Prolene nesis by horizontal mattress suture

三、 兔肩袖损伤模型的建立

取所有兔的右肩关节作为手术侧，用 3% 的戊巴比妥钠 ( 1ml / kg ) 行耳缘静脉缓慢推注，麻醉成功后固定于动物手术台，常规备皮、消毒、铺无菌巾。沿兔肩胛冈远端 2 cm 作纵行切口，钝性分离三角肌并暴露兔岗上肌，于大结节止点锐性切断冈上肌腱，用刀片沿肱骨大结节至冈上肌近端方向剥离约 0.8 cm×0.5 cm 的冈上肌区域建立兔全层肩袖损伤模型，剥离下的冈上肌 ( 图 1a )。冈上肌游离端用缝线标记以便二次手术准确定位。术后常规饮食，庆大霉素 ( 3 mg / kg ) 右后腿肌注预防感染，持续3 天，术后单笼限制性饲养，无须制动固定。

四、实验分组及实验过程

24 只造模后的兔子随机分为实验组 ( n＝12 ) 和对照组 ( n＝12 )。实验组即辛伐他汀 / 明胶海绵复合物组，造模后 1 周将右侧大结节上残留的纤维软骨完全剔除，牙科磨钻将冈上肌腱-骨结合部分打磨一骨槽 ( 10 mm 长，5 mm 宽，2 mm 深 )，用直径为0.8 mm 的克氏针自骨槽内侧向大结节外侧皮质钻两个交叉的骨孔，将辛伐他汀 / 明胶海绵复合物填塞入骨槽内，5-0 Prolene 不可吸收缝线以水平褥式缝合法穿过骨孔将冈上肌肌腱断端拉回骨槽，并在肱骨大结节外侧皮质打结固定 ( 图 1b )。对照组仅填塞入明胶海绵，其余处理同前述。

五、检测方法

1. 大体观察：观察有无伤口感染、免疫反应以及 BTJ 愈合情况等。

2. 生物力学测试：两组于术后 2、4、8 周各处死 4 只兔子，以冈上肌止点为中心，截取整个冈上肌及近端肱骨，将标本固定在美国 Instron-3300 万能材料试验机上进行拉断测试，载荷率为 5 mm /min，测量最大抗拉强度及刚度 ( 图 2 )。

3. HE 染色观察：将生物力学测试完的标本置于10% 甲醇溶液中固定后 24 h 行甲酸脱钙，脱钙完全后梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，最终以5 μm 厚度切片行 HE 染色。

六、统计学处理

用 SPSS 17.0 统计软件对各组数据进行处理，所有数据以±s表示，组间均值比较采用独立样本t 检验，组内比较采用单因素方差分析。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、大体观察所见

所有兔子术后均存活，切口愈合良好，未见渗液、感染及辛伐他汀不良反应。实验组 BTJ 愈合可，可见轻度炎症反应；对照组肩关节积液较多，瘢痕粘连较重，部分 BTJ 呈腱-骨分离状态。

二、生物力学检测

实验组的最大抗拉强度和刚度在 2、4、8 周逐渐增加，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )；实验组2 周最大抗拉强度和刚度与对照组差异无统计学意义( P＞0.05 )；实验组术后 4、8 周的最大抗拉强度和刚度均高于对照组，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )。提示实验组的力学性能高于对照组 ( 表 1，2 )。

表1 术后各时间点最大抗拉强度 ( N )Tab.1 Results of maximum tensile strength at different time points after surgery ( N )

表2 术后各时间点刚度 ( N / mm )Tab.2 Results of stiffness at different time points after surgery ( N /mm )

三、HE 染色

实验组 2 周腱-骨界面可见大量新生毛细血管和较多成纤维细胞增生，并夹杂大量炎性细胞浸润 ( 图 2 )。对照组 2 周肌腱与骨结合松散，中间有疏松结缔组织，可见梭形成纤维细胞增生，炎性细胞数量较实验组少 ( 图 3 )。实验组 4 周炎性细胞数量显著减少，可见较多新生毛细血管和软骨细胞增生 ( 图 4 )。对照组 4 周肌腱与骨结合较 2 周时致密，梭形成纤维细胞遍布视野，未见软骨细胞( 图 5 )。实验组 8 周腱-骨界面已出现典型的四层移行带结构，层次清楚，可见“潮线”以及密集的Sharpey 纤维 ( 图 6 )。对照组 8 周肌腱与骨连接较为致密，腱-骨界面可见疏松无序的 Sharpey 纤维( 图 7 )。

图2 实验组 2 周 ( HE × 100 ) Fig.2 2 weeks postoperatively in the experimental group ( HE × 100 )

图3 对照组 2 周 ( HE × 100 ) Fig.3 2 weeks postoperatively in the control group ( HE × 100 )

图4 实验组 4 周 ( HE × 100 ) Fig.4 4 weeks postoperatively in the experimental group ( HE × 100 )

图5 对照组 4 周 ( HE × 100 ) Fig.5 4 weeks postoperatively in the control group ( HE × 100 )

图6 实验组 8 周 ( HE × 100 ) Fig.6 8 weeks postoperatively in the experimental group ( HE × 100 )

图7 对照组 8 周 ( HE × 100 ) Fig.7 8 weeks postoperatively in the control group ( HE × 100 )

讨 论

肩袖对维持肩关节的稳定和活动起着十分重要的作用。肩袖损伤后由于肌腱挛缩粘连、脂肪浸润以及术后腱-骨愈合不良等原因常导致再次撕裂。正常的肩袖止点愈合又称为直接愈合，是较为理想的腱-骨愈合方式，即腱-骨界面依次由肌腱，未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨组织形成牢固的直接止点。而肩袖修复术后肌腱与骨多以纤维瘢痕组织粘连，难以形成直接止点结构，稳固性大大降低。因此，如何促进肩袖止点的直接愈合成为运动医学科医生研究的热点。

目前促进腱-骨愈合的方法有很多，其中包括间充质干细胞、冲击波、骨膜移植、富血小板血浆[7-8]。辛伐他汀属于 HMG-CoA 还原酶抑制剂，是临床上常用的降脂药物。有研究表明辛伐他汀能够增强血管内皮生长因子 mRNA 和蛋白质的表达，来促进血管和骨的生成从而刺激骨折愈合[9-10]。同样，辛伐他汀对腱-骨愈合的积极作用也与血管生成和骨形成增加有关。在实验组 2 周，腱-骨界面可见大量新生毛细血管生成，证明辛伐他汀能够增强腱-骨界面的血管再生，从而促进腱-骨愈合。而且在腱-骨愈合中，新生血管的生成比骨的生成意义更大，因为新生血管的生成意味着腱-骨界面的骨再生[11]。在实验组 2 周，腱-骨界面可见大量炎性细胞浸润，是由于腱-骨愈合的早期需经历炎症机化，而辛伐他汀对炎症因子具有调节作用，它可以使炎性细胞在趋化因子的作用下向腱-骨界面迁移从而引发炎症反应，各种炎性细胞可以释放大量生长因子来促进腱-骨愈合。另外，辛伐他汀也可促进软骨细胞和成纤维细胞的生成。在实验组4 周，腱-骨界面可见大量软骨细胞和成纤维细胞增生，纤维软骨移行带逐渐形成，但以未矿化的纤维软骨为主，未见明显的“潮线”结构以及 Sharpey纤维，表明腱-骨界面正逐渐形成直接止点。实验组四周炎症细胞数量显著减少，表明腱-骨愈合进程由炎症机化期进入到软骨修复期。到实验组8 周，腱-骨界面已大致出现典型的四层结构，其间可见“潮线”结构以及 Sharpey 纤维。而对照组在各时间点腱-骨界面结合松散，新生毛细血管、炎性细胞及软骨细胞明显少于实验组，腱-骨愈合缓慢。在生物力学方面，实验组 2 周最大抗拉强度及刚度与对照组差异无统计学意义，这是由于腱-骨界面在最初 14 天主要以纤维组织瘢痕增生为主，弹性差，脆性高，未形成牢固的纤维软骨带，因此在此时期患者容易发生再次撕裂。有研究表明，腱-骨愈合部位转化生长因子-β1 ( TGF-β1 ) 的表达在 10 天左右达到高峰并一直持续到术后 3～4 周[12]。笔者猜测，腱-骨界面的瘢痕增生主要与 TGF-β1 的表达增加有关。而到术后第 4 周及第8 周，实验组的最大抗拉强度及刚度均明显高于对照组 ( P＜0.05 )，表明此时腱-骨界面的愈合方式已由瘢痕增生逐渐转变为直接愈合，纤维软骨以及新生骨小梁逐渐向腱-骨界面内长入，腱-骨界面的抗拉强度及刚度明显增加。证明辛伐他汀能够促进腱-骨界面的直接止点的形成，增强其生物力学强度，促进腱-骨愈合。

由于辛伐他汀不能很好地吸收，口服给药须经肝脏的首过消除，到达体循环的不足 5%，生物利用率低[13]。超大剂量的全身应用辛伐他汀会增加肝衰竭，肾脏疾病，横纹肌溶解，肌痛等风险[14]。本研究采用了以明胶海绵作为载体，将辛伐他汀缓慢持久的递送到局部组织，避免了药效的流失。明胶海绵具有无毒性、可降解性、良好的三维结构、生物相容性以及生物安全性，是较为理想的载体材料。临床上常用来作为可吸收填塞物[15]。辛伐他汀已被证明具有局部和全身抗炎特性，但是不同于全身给药，局部高剂量输送辛伐他汀会影响细胞和组织，并引起严重的炎症反应。因此，选择合适的局部用药剂量十分重要。Wong 等[16]用含有 0.5 mg 辛伐他汀应用于兔骨缺损模型，骨修复效果显著。也有动物实验证实[17]，1 mg 辛伐他汀和硫酸钙的组合治疗大鼠颅盖骨缺损，成骨作用明显。Stein 等[18]在大鼠下颌骨骨膜上局部施用不同剂量的辛伐他汀( 0.1，0.5，1.0 和 2.2 mg ) 来促进骨骼生长。这项研究证明，0.1 mg 的用药剂量与另外三种相比，虽然不会明显引起软组织炎症，但也不能显著刺激骨生长。当辛伐他汀剂量从 2.2 mg 减少到 0.5 mg 时，炎症不但可以降低至临床上更为接受的水平，而且不会牺牲骨的生长潜力。同样有研究证明[19]，局部应用 0.5 mg 辛伐他汀可以明显减少临床炎症并保持显著的骨生长。因此，本实验选用 0.5 mg 的辛伐他汀作为注射剂量，达到了促进腱-骨愈合的效果。

本次实验将明胶海绵作为载体，将辛伐他汀局部应用到建立的兔肩袖损伤模型中，材料安全且价格便宜，具有促进肩袖损伤修复术后腱-骨愈合的作用。但是本实验样本量较少且辛伐他汀剂量单一，在未来的研究中，应该在大量动物实验基础上进行剂量递增研究。