HPLC法测定蚂蚁中胆固醇的含量

马春娟，单柏宇，路 芳，徐 阳

(1.长春医学高等专科学校，吉林长春 130031；2.白城市食品药品监督管理所，吉林白城 137000)

蚂蚁作为保健品被人类所食用具有悠久的历史，对治疗人类疾病方面具有重要作用。全世界有15000种蚂蚁，我国约有2000种，其中具有食用和药用价值的约有10种，例如拟黑多刺蚁、双突多刺蚁、黄猄蚁、大黑蚁、巨头切叶蚁、日本弓背蚁、铺道蚁等[1-4]。国内外文献资料表明，可食用蚂蚁营养价值高，并具有多种保健和治疗疾病的功能，堪称“微型动物营养宝库”和“天然药物加工厂”[5-6],例如抗病毒、抗炎、增强免疫、清除乙肝病毒的功能[7]，对肾虚、头昏耳鸣、失眠多梦、阳痿遗精、风湿痹痛、中风偏瘫、手足麻木、红斑性狼疮、硬皮病、皮肌炎、痈肿疔疮、毒蛇咬伤有一定疗效，尤其是在抗疲劳方面尤为突出[8-10]。

胆固醇又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇具有重要的药理作用，对维持人体正常的生理功能具有重要作用[11-13]。胆固醇是激素类物质合成的原料，可经代谢转化为类固醇激素，类固醇激素对抗疲劳方面具有重要作用，故胆固醇的含量对蚂蚁抗疲劳活性具有重要影响[14]。过高地摄入胆固醇可形成高脂血症，引起动脉粥样硬化，进而诱发冠心病、高血压等一系列心脑血管疾病[15-17]。因此，适度控制外源性胆固醇摄入是预防动脉粥样硬化及心脑血管疾病的重要措施，故测定蚂蚁中胆固醇的含量可以指导特定人群对蚂蚁及其提取物的食用量[18-19]。

目前，国内文献尚没有关于HPLC法测定蚂蚁中胆固醇含量的相关报道。因此，建立一种快速、高效的胆固醇含量的测定方法是非常必要的。本文利用HPLC法检测蚂蚁中胆固醇的含量，方法精密度高，快捷、有效，为蚂蚁的鉴别、质量控制和食用指导奠定研究基础。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试药

电子天平(AVW20D型，日本岛津制作所)；超声波清洗器(KQ-400KDE型，昆山市超声仪器有限公司)；液相色谱仪(Aglient 1260型，美国安捷伦有限公司)。

水为娃哈哈纯净水；胆固醇标准品(含量≥98%，批号：111618-200301)；甲醇为色谱纯，二氯甲烷为分析级试剂。蚂蚁(经长春中医药大学生药教研室李波老师鉴定为蚂蚁，产地见表1)

1.2 对照品的配制

精密称取胆固醇标准品约5.0mg，置100mL容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解，甲醇定容至刻度，即浓度为0.05mg/mL胆固醇对照品溶液。

1.3 供试品溶液的配制

取适量蚂蚁放置于105℃鼓风干燥箱中干燥约7～8h至恒重，冷却研磨至粉末。精密称取蚂蚁粉末约10g，加200mL的二氯甲烷超声提取约15min，同法提取3次，合并滤液，回收溶剂，用适量甲醇溶解，至10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱条件及系统适应性实验

色谱柱为Agilent TC-C18(250mm×4.6mm，5μm),流动相为甲醇∶水(V/V,98∶2)，流速为1mL/min，检测波长为205nm，柱温为30℃，进样量为10μL。理论塔板数按照胆固醇计算均不小于3000，在此条件下，胆固醇与其它物质分离度大于1.5，符合药典要求，色谱图见图1、图2。

2.2 线性关系考察

精密称取胆固醇对照品10.51mg，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得浓度为1.05mg/mL的胆固醇母液。精密吸取胆固醇母液2mL、1mL、0.5mL、0.3mL、0.1mL、0.1mL，置于10mL、10mL、10mL、10mL、10mL、25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即浓度为0.2102mg/mL、0.1051mg/mL、0.0525mg/mL、0.0315mg/mL、0.0105mg/mL和0.0042mg/mL溶液。按照2.1中色谱条件分别将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积。以色谱峰面积(Y)对溶液浓度(X)作图，得到胆固醇的回归方程为Y=6.3845X-5.3825，r=0.9996(n=6)，表明胆固醇浓度在0.0042～0.2102mg/mL范围内线性关系良好。

2.3 精密度试验

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液(20170301)各10μL，按照2.1中色谱条件重复注入高效液相色谱仪6次，测得胆固醇色谱峰面积的RSD值分别为1.02%和1.91%，结果表明此方法精密度良好。

2.4 稳定性考察

将供试品溶液(20170301)，分别在0，2，4，6，8，10，12h时，依次进样，测得胆固醇色谱峰面积的RSD值为1.68%(n=7)，结果表明供试品溶液中胆固醇在12h内稳定。

2.5 重复性实验

按照1.3中供试品配制方法，分别配制6份蚂蚁(20170301)供试品溶液，依法进行含量测定，并计算出其含量的RSD值为1.87%，结果表明此方法重复性良好。

2.6 加样回收率实验

精密称取胆固醇标准品5.05mg，定容至10mL，吸取1mL，分别加入6份约5g的蚂蚁样品(20170301)中，按照1.3中供试品配制方法进行配制，得6份加样回收率供试品，进入高效液相，测定含量，计算回收率。结果胆固醇的平均回收率为99.12%，RSD值为1.77%(n=6)，表明此方法回收率良好。

2.7 样品测定

取品种不同产地的蚂蚁样品，按照制备供试品方法制备，分别精密吸取对照品和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪中，进行含量测定，记录色谱峰面积，并按照外标法计算供试品溶液中胆固醇的含量，结果见表1。

表1 不同产地蚂蚁中胆固醇的含量

3 讨论

对比浸渍法、超声提取法和热回流提取法，结果发现超声提取法和热回流提取法提取效率较高，但是由于热回流提取法提取时间较长，且操作复杂，故最终确定超声提取法。

对比甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸-水，乙腈-磷酸-水的色谱条件，最终确定甲醇-水为最佳的流动相。由于胆固醇的极性较小，水相比例的增大，虽然可以提高胆固醇的分离效果，但对出峰时间影响较大，同时考虑分离效果和测定效率，最终确定甲醇-水(V/V，98∶2)。

对比不同波长对样品含量测定的影响，发现胆固醇在较低波长下具有良好的吸收，但由于吸收波长较低，基线的波动较大，且影响胆固醇供试品中胆固醇的分离，故最终选取波长为205nm。

胆固醇具有多方面的药效作用，是蚂蚁中重要的甾体类成分，不仅可以直接影响蚂蚁抗疲劳方面的药效作用，且对于其它甾体类成分的合成具有重要影响，故本文建立一种可以快速和准确测定蚂蚁中胆固醇的方法，为蚂蚁的质量控制奠定研究基础。本文对东北地区拟黑多刺蚁和红蚂蚁中胆固醇的含量进行测定，并进行对比，发现同品种，不同产地的拟黑多刺蚁和红蚂蚁胆固醇的含量差异很大，红蚂蚁中胆固醇的含量要普遍高于拟黑多刺蚁中的含量。