探讨用分型方法检测溯源副溶血性弧菌

李玉 徐艳霞 句立言 孙红 潘玉辉 孙婷媛

副溶血性弧菌（VP）是在被污染或者携带传播疾病食品中存在的病原菌，和食品安全具有紧密的联系，因此政府和社会对其比较关注[1-2]。溯源是对病原菌的来源，亲缘关系等进行分析，对流行性进行预测，提前进行防控的手段。此次我们对血清分型、PFGE和ERIC-PCR等方式的分型情况开展了分析研究。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

此次收集了食品来源VP607株，患者和食物中毒VP480株，对这些菌株进行了血清分型，并采取了PFGE基因分析和ERIC基因分析，对感染源追踪，了解其溯源和亲缘关系等情况。

1.2 方法

参照美国PulseNet PFGE标准化方法[3-4]，（1）制胶块：2 ml细胞悬浮液（CSB），挑取新鲜培养物，均匀悬浊，使菌液浊度至20%透射值。将混合物加入模具孔中制成胶块，4℃ 10 min冷却。（2）蛋白消化：3 ml细胞裂解液（CLB）溶液加入15 μl蛋白酶K（20 mg/ml）（最终浓度0.1 mg/ml），用模具梳子将胶块直接取出，投入CLB中54℃水浴2 h。弃液，凉至室温，加3 ml TE，置4℃保存。（3）酶切。（4）制胶：将酶切后的样品胶置于样品梳上，摆放到模具上。（5）电泳：电压6 V/cm，电泳时间19 h，脉冲参数（2～10 s，13 h）：（20～25 s，6 h），电泳温度14℃。（6）染色：电泳结束后，将凝胶取出，用0.5 μg/ml的Goldview染色30 min，去离子水脱色30 min。（7）读胶：用凝胶成像仪读胶分析。

2 结果

来自食品来源的607株菌株共分成了10个血清群，有30株无法分型的海产品分离株VP，这可能是新的血清群，分型率是94.64%，0：6群和0：5群为流行优势株；来自患者和食物中毒的480株菌株分成了6个血清群，0：3群为流行优势株。海产品VP分成了PFGE型29个，患者和食物中毒菌株PFGE型为12个。261株不同来源的VP分出42个ERIC基因型。有141株是海产品中的，有60例株是腹泻患者的，食品和环境VP的ERIC-PCR多态性电泳条带。

3 讨论

VP菌株血清分型和许多的胃肠道急性疾病有紧密联系[5-6]，VP是上世纪末在世界范围内流行的优势菌株，在现今社会也有很高的流行度，其感染和蔓延能力受到了广泛的关注。海产品分离VP优势株和患者分离优势株存在差异性，致病风险情况还有待实验验证。海产品有可能导致VP食品源的爆发和扩散，需要引起我们的关注。此次研究有30株无法分型的海产品分离株VP，这可能是新的血清群。表明VP血清分型具有局限性。

PFGE分型由Schwarts和Cernter建立，通过改变电场方向来分析DNA分子[7-8]。分型过程需要对细菌染色体结构进行检测，其准确度高，稳定性高，对菌株微小差异能够显示。此次研究中我们认为海产品分离株VP大部分都不会导致食物中毒和腹泻。

ERIC-PCR分型是通过肠杆菌科和弧菌属细菌的短重复序列在不同菌种上的差异性进行分析。ERIC-PCR是对细菌基因分型比较有效的方式，对菌株的亲缘关系和溯源具有优势。可以研究菌株间致病能力的关联性。

总而言之，三种分型方式对于VP分型都有效果，各有特点。血清分型能够对VP流行优势型进行溯源，但分辨率低，费时，复杂，对菌株关系无法确定，无法溯源。PFGE和ERIC-PCR对VP进行有效分型，也能够确定菌株间的亲缘关系，对致病性相关性研究有帮助。推介两种或多种分型方式共同使用，可以更快更准确的进行分型，防控VP导致的腹泻和食物感染事件。

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