响应面法优化红菊苣中花青素的提取工艺研究

王凤娟， 孙飞龙， 叶文文， 宁景叶

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安 710048）

红菊苣（Cichoricumintybusvar.foliosumHegi）是海水蔬菜的一种，又名软化白菊苣、软化、结球红菊苣、结球绿菊苣等，叶球鲜红色，为野生菊苣（CichoricumintybusL.）的变种（朱建星等，2017）。 目前对其栽培技术、总黄酮提取工艺以及绿原酸的研究较多，对红菊苣中花青素的研究还不够深入（王记莲等，2015）。花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，也是水果、蔬菜、花卉中的主要呈色物质（付辉战等，2017）。由于不同植物所含有的细胞液pH不同，因此呈现出不同的颜色。在自然条件下很少存在游离状态的花青素，其主要以糖苷—花色苷的形式存在（郑红岩等，2014）。 D'Evoli等（2012）利用液相色谱-串联质谱法对红菊苣花青素进行定性和定量分析，研究表明花青素具有消除自由基、降血脂、抗变异、延缓衰老、提高视力等生理活性。本文以酸性乙醇为提取剂，超声辅助提取红菊苣中的花青素，探讨提取红菊苣中花青素的提取工艺，为红菊苣花青素提取工艺的产业化应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器 红菊苣：将市售新鲜红菊苣置于60℃电热鼓风干燥箱干燥24 h后，粉碎，过60目筛，密封装袋，备用；盐酸、氯化钾、乙酸钠均为分析纯；蒸馏水为实验室自制。

722型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；SK5200LH超声波清洗仪，上海科导超声仪器有限公司；JBZ-100型高速多功能粉碎机，上海罗兰德工贸有限公司；AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；DGF-1AB型立式电热鼓风干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司；SHZ-D（III）循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器厂；三用电热恒温水箱，天津市泰斯特仪器有限公司；酸度计，上海任氏电子有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 技术路线 红菊苣原材料→超声波辅助乙醇提取→单因素试验→响应面优化→抽滤→吸光值测定

1.2.2 试剂配制

pH=1.0 的缓冲溶液：0.2 mol/L KCl∶0.2mol/L HCl=25∶67，V/V；

pH=4.5 的缓冲溶液：0.2 mol/L NaAc·3H2O∶0.2 mol/L HAc（杨萍，2017）。

1.2.3 红菊苣中花青素的测定 根据花色苷特有性质，本试验采用pH示差法测定花青素的含量（涂宗财等，2011），移取2.5 mL待测液定容到25 mL容量瓶中，取稀释后的待测液2 mL，加入pH为 1.0、4.5的缓冲液 8 mL，30℃水浴平衡30 min，以蒸馏水作为空白对照，用紫外分光光度计测定花青素在520 nm和700 nm处的吸光值，以矢车菊-3-葡萄糖苷计，利用Fuleki公式对待测液中花青素含量进行测定（Fuleki，2010）。

式中：V为提取液总体积，mL；DF为稀释倍数；M-Cy-3-Glu（矢车菊-3-葡萄糖苷）的相对分子质量，449.2 g/mol；ε-Cy-3-Glu 的 消光系数 ，29600 L/mol/cm；m 为样品质量，g；L 为光程，数值为1 cm。

1.3 红菊苣中花青素提取的单因素试验 分别考虑不同液固比、乙醇体积分数、超声时间对花青素提取量的影响，进行单因素试验，使用pH示差法对花青素含量进行测定，确定最佳提取因素。每个试验平行三次。

1.3.1 液固比的确定 称取6份一定质量的红菊苣于锥形瓶中，按液固比（mL：g）为 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 与 70%酸性乙醇（含 0.1%盐酸）混匀，在200W、40kHz条件下避光超声30 min，抽滤提取液，冷却，将滤液转至25 mL烧杯中作为待测液。按照1.2.3红菊苣中花青素的测定方法进行测定。

1.3.2 乙醇体积分数的确定 依照1.3.1中的方法，分析乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%对红菊苣中花青素提取量的影响。

1.3.3 超声提取时间的确定 依照1.3.1中的方法， 分析超声时间为 20、30、40、50、60、70 min 对红菊苣中花青素提取量的影响。

1.4 响应面法优化红菊苣中花青素的提取条件根据单因素试验对液固比、乙醇体积分数、超声提取时间进行综合考虑，采用三因素三水平响应面分析法，根据Box-Behnken Design（BBD）设计响应面试验，分析红菊苣花青素在不同提取条件下的含量，从而优化出最佳提取条件（王凤娟等，2017；Zhao等，2015）。试验因素与水平设计见表1。

表1 中心组合Box-Behnken因素水平表

2 结果与讨论

2.1 液固比对红菊苣中花青素提取量的影响从图1可以看出，随着液固比的增加，花青素提取量也增加，并在液固比为40∶1时，花青素提取量最多。继续增加液固比，花青素提取量减少，因为在一定提取温度下，花青素的溶解度是一定的，因此随着提取溶剂的增加，花青素提取量也增加，当提取剂达到某一值时，花青素不再溶解，此时再增加溶剂体积，不仅增加成本，而且使其杂质含量也增加，故选择液固比为40∶1为宜（武中庸等，2017）。

图1 液固比对花青素提取量的影响

2.2 乙醇体积分数对红菊苣中花青素提取量的影响 从图2可以看出，花青素提取量随乙醇体积分数增加而增加，在乙醇体积分数为70%时达到最大，之后随乙醇体积分数的增加而减少，主要原因是乙醇体积分数越大，提取剂极性越大，导致花青素溶解度下降，故乙醇体积分数应选择70%。

图2 乙醇体积分数对花青素提取量的影响

2.3 超声提取时间对红菊苣中花青素提取量的影响 从图3可以看出，初始时，超声提取时间越长花青素提取量越高，当超声提取时间为30 min时花青素的提取量最高，随后呈下降趋势。由于超声波的空化效应和机械作用会破坏花青素结构，并且随着超声时间增长提取温度相应的升高，高温会导致花青素分解，降低提取量。故超声提取时间为30 min。

图3 超声提取时间对花青素提取量的影响

3 响应面法优化红菊苣中花青素的提取工艺研究结果

3.1 响应面试验设计及结果 利用Box-Behnken Design试验设计原理，选取液固比、乙醇体积分数、超声提取时间进行三因素三水平试验分析，共17个试验点，响应面试验设计及结果见表2。

利用Design-Expert 8.05b软件对表2试验数据进行方差分析和多元回归拟合，方差分析结果见表3。拟合的多元回归方程为：Y＝908.58+1.73A+6.58B-14.52C+28.20AB-25.60AC-4.75BC-58.06A2-40.38B2-45.96C2。整体模型显著性水平P＜0.0001，表明二次方程模型达到极度显著水平；回归方程的相关系数 （R2＝0.9886，Adj-R2＝0.9739，Pred-R2＝0.8522）及变异系数 CV（0.98%）均表明模型方程能够较好地反映真实的试验值。因此，可以用该模型对试验结果进行分析及预测。从表3可以看出，超声提取时间一次项以及液固比、超声功率、提取时间的二次项，以及液固比和乙醇体积分数的交互项、液固比和超声提取时间的交互项对响应值的影响都达到极显著水平（P＜0.01），响应值的变化较复杂，各个试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而应呈二次抛物面关系。从各变量显著性检验P的大小，可以得出所研究各因素对红菊苣中花青素提取效果影响大小顺序依次为超声提取时间＞乙醇体积分数＞液固比。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归模型方差分析

3.2 交互项对试验结果的影响 三维响应面图可更直观的看出两因素对因变量的影响情况，可以直接找出最优范围，三维响应面在底面的投影图即为二维等高线图，响应面坡度越平缓，外界影响条件对其影响越小，响应值的大小变化越小。比较分析图4～图6两两交互作用大小依次为液固比和乙醇体积分数，液固比和超声提取时间，乙醇体积分数和超声提取时间。

图4 液固比和乙醇体积分数对试验结果的影响

图5 液固比和超声提取时间对试验结果的影响

图6 乙醇体积分数和超声提取时间对试验结果的影响

3.3 红菊苣中花青素提取最优工艺及其验证经过响应面法优化提取工艺，确定的最优提取条件为液固比40.86∶1，乙醇体积分数为71.22%，超声提取时间为28.12 min，花青素的提取量为910.426 mg/100g。为了操作方便，将上述条件修正为液固比41∶1，乙醇体积分数71%，超声提取时间28 min，在此条件下进行3次平行试验，花青素提取量为908.596 mg/100 g，RSD为0.1%，与理论值相比误差为1.83 mg/100 g。

4 结论

采用超声波辅助提取红菊苣中花青素，通过以液固比、乙醇体积分数、超声提取时间为提取单因素，采用响应面分析法进行三因素三水平的优化设计试验。分析结果表明，3个因素中对花青素提取量影响大小为超声提取时间＞乙醇体积分数＞液固比。最佳提取工艺为液固比41∶1，乙醇体积分数71%，超声提取时间28 min，在此条件下，花青素的提取量为908.596 mg/100 g，与模型中预测值910.426 mg/100 g相差不大，模型可用于实际预测。