亚硝酰氢对冷藏草莓保鲜效果的影响

高彬 周慧 张树芹 朱树华

摘要：为探究亚硝酰氢（nitroxyl，HNO）对草莓果实冷藏保鲜效果的影响，以“甜查理”草莓作为试验材料，用不同浓度HNO供体1-亚硝基环己酸酯（1-nitroso cyclohexanoate，NCA）溶液浸泡处理草莓果实，在0℃条件下恒温贮藏，研究不同浓度HNO供体处理对“甜查理”草莓采后冷藏期间果实硬度、可溶性固形物、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脯氨酸含量及抗氧化酶活性等的变化。结果表明，HNO供体处理有效地保持了采后草莓果实的硬度，减缓了果实中可溶性固形物含量的升高，抑制了ROS和MDA含量的升高，减缓了脯氨酸含量降低，使草莓果实在采后冷藏过程中能较长时间保持果实风味。HNO供体处理延缓草莓超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，抑制过氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性，从而增强对超氧自由基的清除能力，减轻超氧自由基引起的伤害，延缓果实褐变腐败。综合来看，当HNO浓度为0.2 g/L時，草莓的冷藏保鲜效果最佳。

关键词：草莓；亚硝酰氢；冷藏；贮藏品质

中图分类号：S668.4：TS255.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0129-07

Abstract To investigate the effect of nitroxyl （HNO） on preservation of strawberry fruits during cold storage， the strawberry fruits of Sweet Chalie cultivar were treated with different concentrations of HNO donor solution and stored at 0℃. The physiological indicators including fruit firmness， soluble solid content， reactive oxygen （ROS） activity， malonaldehyde （MDA） content， proline content and antioxidant enzyme activities were investigated in this paper. The results showed that HNO donor treatment effectively maintained the fruit firmness of postharvest strawberry fruits， delayed the decrease of soluble solid content， inhibited the contents of reactive oxygen species and malondialdehyde， and delayed the content decrease of proline， so the strawberry fruits could be preserved for longer time with better flavour under cold storage. The HNO treatment decreased the increase of SOD activity and inhibited the activities of POD and PPO of strawberry during storage， so as the ability of scavenging superoxide radicals was enhanced and the damage caused by superoxide radicals was reduced， which delayed the fruit browning and rot. In conclusion， treating strawberry fruits with 0.2 g/L HNO could obtain the optimum preservation effect under cold storage.

Keywords Strawberry fruits； HNO； Cold storage； Quality

草莓（Fragaria ananassa Duch）属蔷薇科草莓属多年生常绿草本植物，由于其色艳形美、柔软多汁、酸甜可口，有较高的营养价值，被誉为“水果皇后”，受到广大消费者青睐。但是，草莓含水量高，组织娇嫩，极易受机械损伤和真菌感染，腐败变质，限制了草莓的销售与加工。因此，研究适宜的草莓贮藏保鲜技术，使其保持较好的品质，降低草莓采后损失是草莓生产销售中的当务之急。

在草莓保鲜方面，国内外开展了大量研究。不同的保鲜剂对草莓具有不同的保鲜效果。余璐璐等[1]发现，20 μmol/L水杨酸处理草莓后，草莓采后储藏保鲜时间明显延长，处理后的草莓可在常温下保鲜6 d以上。安磊等[2]比较了壳聚糖、海藻酸钠、魔芋葡甘聚糖的保鲜作用及特点，表明3种多糖对草莓贮藏期内的多个生理生化指标具有明显的改善作用，能有效延长草莓货架期；其中壳聚糖保鲜作用最好，魔芋葡甘聚糖对草莓有机酸的维持作用最好。

亚硝酰氢（nitroxyl，HNO）可以参与许多化学和生物反应过程。例如，细菌反硝化过程可生成HNO[3]；HNO作为氧化剂可以氧化还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）[4， 5]；HNO作为还原剂可以将超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的Cu2+还原成Cu+：NO-+ SODCuⅡ→ NO + SODCuⅠ[6]；HNO还可以与氧化的血红蛋白（如高铁血红蛋白）反应生成亚硝酰亚铁：HNO+HbFeⅢ→HbFeⅡ-NO+H+[7]。Miranda等[8，9]使用反应动力学来确定HNO与各种化学/生物反应物反应的相对反应速率，并推导出近似的速率常数；HNO的相对反应速率为：氧合肌红蛋白>谷胱甘肽（glutathione，GSH）、辣根过氧化物酶>N-乙酰半胱氨酸、CuZnSOD、MnSOD、高铁肌红蛋白、过氧化氢酶>氮氧自由基、铁螯合物C>O2。由于细胞内存在较高浓度的GSH，上述结果表明细胞中大部分HNO可能与GSH反应消耗有关[10]。HNO也可以与泛醇[11]、细胞色素C[12]、锰超氧化物歧化酶[13]和黄嘌呤氧化酶[14]反应生成NO，同时HNO在医药领域与心血管病、动脉硬化、糖尿病等众多疾病有着紧密的关系[15-17]，近年来引起了广泛关注，但HNO作为保鲜剂的研究鲜有报道。

为此，本研究以“甜查理”草莓為研究材料，选用不同浓度的HNO供体1-亚硝基环己酸酯（1-nitroso cyclohexanoate，NCA）溶液，研究NCA释放的不同浓度HNO处理后草莓冷藏期间的各种生理指标的变化，以期为HNO用于水果保鲜奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草莓品种为“甜查理”。从长势良好的植株上随机挑选大小均匀、无机械损伤、无病虫害的带柄七成熟果实，采摘后立刻运回实验室，4℃下预冷24 h。

硫代巴比妥酸、核黄素、乙二胺四乙酸购自国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸、甲苯购自天津市永大化学试剂有限公司；氮蓝四唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）购自苏州亚科科技有限公司；联苯胺购自阿拉丁试剂有限公司；磺基水杨酸购自上海山浦化工有限公司；NCA为实验室自制。

1.2 仪器与设备

A11Bs25型粉碎机（德国IKA公司），BS124S型电子分析天平（德国赛多利斯），HH-2型恒温水浴锅（国华电器有限公司），PHS-3D型pH计（上海精科雷磁有限公司），GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），UV-2450型紫外分光光度计（日本岛津公司），WY015R型手持折光仪（辽宁赛亚斯科技有限公司），GY-4型果实硬度计（山海山度公司）。

1.3 试验方法

试验分为两组，处理组以NCA为HNO供体，分别配制成浓度为0.1、0.2、0.3 g/L的溶液浸泡草莓，对照组（CK）以蒸馏水浸泡草莓。每组浸泡5 min，擦干表面溶液，将草莓置于0℃恒温恒湿柜中，每天取样一次，共取样5 d。取样时将果肉切块后液氮冷冻处理，样品置于-80℃冰箱保存备用。各指标测定时均重复3次。

1.3.1 果实硬度和可溶性固形物测定 用GY-4果实硬度计测定果实硬度，探头直径5 mm。测试结果取下压峰值，每种处理取5个果实，每个草莓果实取2个测量点测试，共重复10次。

将草莓果实在研钵中研磨，吸取草莓汁，用手持式折光仪测定其可溶性固形物含量。

1.3.2 酶活性测定 取5 g草莓冷冻研磨，加入15 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8）振荡混匀，充分浸提10 min，4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液为粗酶液。

SOD活性采用NBT光还原法测定[18]。取粗酶液30 μL，加入3 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液〔含13 mmol/L甲硫氨酸，63 μmol/L氮蓝四唑（NBT），1.3 μmol/L核黄素和10 mmol/L EDTA〕，在4 000 lx（光照强度）下反应30 min，出现颜色变化，测定560 nm处吸光度。以未加酶液的反应体系为空白对照，以单位时间内抑制NBT光还原率50%的酶量为一个酶活单位。

POD活性采用联苯胺法测定[19]。将5 mmol/L联苯胺-醋酸钠溶液2 mL与粗酶液1 mL混匀，向混合液中加入1 mL 0.3% H2O2溶液并立即于580 nm波长下检测其吸光度的变化，检测时长为120 s。POD的单位酶活性定义为由POD的催化作用引起的580 nm下每秒内增加0.001个单位的吸光度为一个酶活单位。

PPO活性采用邻苯二酚法测定[20]。取pH 5.8磷酸盐缓冲液1 mL，加入浓度为0.05 mol/L邻苯二酚1 mL，混匀，30℃下水浴5 min，加入2 mL粗酶液迅速摇匀，对照以缓冲液代替粗酶液，在410 nm波长下测定吸光度的变化。在测定条件下每分钟酶液吸光度值改变0.1为一个酶活单位。

1.3.3 丙二醛含量的测定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定[21]。取1 g草莓果实，冷冻研磨，加入10 mL 10%三氯乙酸研磨至匀浆。充分提取后，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液2 mL，加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀后沸水浴15 min，冷却后再次离心，取上清液在450、532、600 nm波长下测定吸光度，根据公式计算MDA浓度=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450，并根据提取液的体积计算样品中丙二醛含量。

1.3.4 活性氧（ROS）含量的测定 参照Kim等[22]的方法，取0.5 g草莓果实，研磨至粉末，加入3 mL Tris-HCl缓冲液（10 mmol/L，pH 7.2），于4℃、12 000 r/min离心20 min，取上清10 μL，加入3 mL Tris-HCl缓冲液（10 mmol/L，pH 7.2），再加入2 mmol/L 2′，7′-二氯荧光素乙二酸盐（DCF-DA）溶液1 μL，混合均匀，在黑暗中室温孵育0.5 h，用荧光分光光度计检测其荧光强度。最大激发波长为485 nm，最大发射波长为530 nm，狭缝为5 nm。以Tris-HCl缓冲液（10 mmol/L，pH 7.2）作为对照。

1.3.5 脯氨酸含量的测定 参照Bates等[23]的方法，取1 g草莓果实，研磨至粉末，加入10 mL 3%磺基水杨酸溶液，振荡混匀。沸水浴浸提10 min，冷却至室温后，于4℃、4 000 r/min离心15 min，吸取2 mL上清液，加入2 mL冰醋酸和3 mL 25%酸性茚三酮显色液，沸水浴加热40 min后冷却。加入5 mL甲苯充分振荡，萃取红色物质，静置40 min分层，移取甲苯层，紫外分光光度法测定520 nm处吸光度，计算脯氨酸含量。

1.4 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2013处理数据并绘图，DPS 7.5软件对数据进行单因素方差分析，用LSD法在0.05显著性水平进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同浓度HNO供体处理对草莓果实硬度的影响

由图1可见，冷藏条件下，各组草莓果实硬度随时间延长表现为先上升后下降，处理组果实硬度高于对照组，且第1、2 d时差异显著（P<0.05），0.2、0.3 g/L NCA处理组的果实硬度在前3 d保持较高水平，第1 d，两者的果实硬度分别是对照组的1.34、1.31倍，第2 d分别为1.39、1.36倍。说明冷藏下HNO供体处理明显地推迟采后果实软化，较长时间保持了采后草莓的果实硬度，且0.2 g/L HNO供体处理在保持草莓果实硬度方面效果更为显著。

2.2 不同浓度HNO供体处理对草莓果实可溶性固形物含量的影响

可溶性固形物含量的高低反映了贮藏过程中果实褐变的程度[24]。由图2可知，冷藏条件下，可溶性固形物含量随时间延长逐步上升。第1 d时，0.2、0.3 g/L NCA处理组的草莓可溶性固形物含量较高；之后，对照组和0.1 g/L NCA处理组上升较快，而0.2、0.3 g/L处理组上升明显较慢。在3～5 d，0.2 g/L处理组的草莓可溶性固形物含量最低。即在冷藏后期，0.2 g/L HNO供体处理能更好地减缓草莓果实可溶性固形物含量的增加速度，较长时间地保持采后样品果实的完整性，减缓了果实褐变。

2.3 不同浓度HNO供体处理对草莓果实酶活性的影响

由图3可知，SOD活性随冷藏时间延长先升高再下降。各组峰值均出现在第2 d，其中0.2 g/L NCA处理组为对照组的1.30倍。整体来说，0.2 g/L NCA处理的SOD活性高于其它处理，说明0.2 g/L HNO供体处理可以较长时间地保持采后草莓的果实品质。

由图4可知，POD活性随冷藏时间延长先上升后下降。除第5 d外，各处理组POD活性均低于对照组且0.2 g/L NCA处理组的POD活性最小，前2 d时显著低于对照组（P<0.05）。说明冷藏下HNO供体处理明显降低了POD活性。

由图5可知，随冷藏时间延长，草莓中PPO活性除0.2 g/L NCA处理先上升后持续降低外，其余处理均先上升后下降再上升。除第4 d外，均是0.2 g/L处理组的PPO活性最小，且各处理组皆低于对照组。说明HNO供体处理能够抑制PPO的活性，从而抑制草莓褐变。

2.4 不同浓度HNO供体处理对草莓果实活性氧含量的影响

由图6可知，草莓采后冷藏期间活性氧含量持续升高。采后1 d内，各组间ROS含量差异较小，之后，CK的ROS含量快速上升，明显高于NCA处理组，而0.2 g/L NCA处理组ROS含量则低于其余处理。说明HNO对冷藏期间草莓果实活性氧含量的增加具有较好的抑制效果，以0.2 g/L NCA处理的效果最好。

2.5 不同浓度HNO供体处理对草莓果实丙二醛含量的影响

由图7可知，草莓果实在冷藏期间MDA含量逐步升高。各处理组草莓MDA含量均低于对照组，且0.2 g/L处理组的草莓MDA含量最低。各组MDA含量在前3 d上升均较快，之后对照组继续快速上升，而处理组则上升较慢。说明HNO处理能够减缓采后草莓果实冷藏期间MDA含量的积累，降低草莓果实的膜脂过氧化程度。

2.6 不同浓度HNO供体处理草莓果实脯氨酸含量的变化

由图8可知，各组在冷藏第1 d内脯氨酸含量骤降，之后缓慢下降再略有上升。0.2、0.3 g/L NCA处理组的草莓脯氨酸含量均高于对照。对比可知，HNO供体处理对减缓了冷藏期间果实中脯氨酸含量的降低，有利于提高采后果实的耐贮性，其中尤以0.2 g/L NCA处理的效果最好。

3 讨论与结论

草莓中富含维生素、多酚、糖类、氨基酸等营养物质，香甜可口。但草莓在采摘后，随贮藏时间和成熟度的增加，各项指标均有较大改变，无法维持较高的营养品质。本试验比较了不同浓度HNO供体处理对草莓采后冷藏保鲜的影响。结果表明，不同浓度HNO供体对采后草莓果实相关品质都有一定的保持作用，0.2 g/L HNO供体处理比0.1、0.3 g/L HNO供体处理能更大程度地保持采后草莓的外观、硬度、口感及营养品質，可用于草莓采后保鲜。

蔡琦玮等[25]在研究中发现，果实硬度、含糖量是评价果实风味的常用指标，也是吸引消费者的重要因素。经HNO供体处理的草莓样品果实硬度与可溶性固形物含量能长时间保持较高的水平。脯氨酸是植物体内普遍存在的一种保护物质，在遭受低温、干旱、高盐胁迫时，体内的游离脯氨酸会增加[26]。本研究发现，HNO供体处理延缓了采后果实中脯氨酸含量的降低，使采后草莓在较长时间内保持果实内较高的脯氨酸含量。采后果实贮藏过程中活性氧的积累是导致果实衰老腐败的重要原因之一。一旦植物体内活性氧平衡被打破，过多的活性氧积累对生物大分子以及细胞膜产生破坏作用，从而加剧膜脂过氧化，导致膜脂过氧化终产物MDA的累积[27， 28]。本研究发现，HNO供体处理能够明显抑制采后草莓果实内活性氧与MDA的积累，延缓果实衰老，从而延迟果实腐烂。HNO供体与低温协同处理延迟脯氨酸含量降低的同时还抑制了MDA含量的升高，该结果在南瓜果实中已经被证实[29]。

SOD是细胞内清除活性氧系统的重要酶。SOD催化反应2O·-2+2H+→H2O2+O2，把体内具有潜在危害的O·-2除去，从而有效地阻止O·-2在植物体内积累，使细胞内自由基维持在低水平，防止细胞受自由基的毒害。本试验中HNO处理提高冷藏期草莓SOD活性，增强对超氧自由基的清除能力，减轻超氧自由基引起的伤害，延缓果实衰老[30，31]。而POD和PPO活性与果实褐变密切相关[30]，HNO供体处理通过抑制POD和PPO的活性，导致褐变底物酚类物质合成减少，降低了酚类物质氧化速度，进而延缓了草莓的褐变进程。

因此，冷藏與HNO供体处理在果实采后贮藏期间能有效地保持果实营养品质，延长果实贮藏时间，以冷藏+0.2 g/L HNO供体处理效果最好。

参 考 文 献：

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