棉花Bax inhibitor—1影响内质网胁迫介导的细胞死亡的研究

张景霞 霍雪寒 王芙蓉 张传云 张军

摘要：Bax inhibitor-1（BI-1）是调控内质网胁迫（endoplasmic reticulum stress， ER stress）介導的细胞死亡的关键因子，在植物耐逆中具有重要作用。目前，棉花BI-1（GhBI-1）的耐逆功能及其调控细胞死亡的相关报道较少。在本研究中，采用ER stress专一性诱导毒素——衣霉素（tunicamycin，TM）对棉花幼苗进行胁迫处理，实时定量PCR结果表明，GhBI-1的TM诱导表达具有组织特异性，根GhBI-1对TM的响应更加强烈。通过TM抗性试验及细胞死亡的分析发现，GhBI-1的表达提高了拟南芥的TM抗性，减缓了ER stress介导的细胞死亡。此外，未折叠蛋白反应信号通路中的bZip60转录因子基因的表达受GhBI-1的调控。

关键词：Bax inhibitor-1；内质网胁迫；细胞死亡；棉花；拟南芥；衣霉素

中图分类号：S562.01文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0001-06

Abstract Bax inhibitor-1 （BI-1） regulates cell death mediated by endoplasmic reticulum stress （ER stress）， and plays important roles in plant stress tolerance. Up to now， the role of cotton BI-1 （GhBI-1） involved in stress tolerance and cell death remain largely unknown. In the present study， we characterized the expression patterns of GhBI-1 under ER stress conditions induced by tunicamycin（TM）. The results of real-time quantitative PCRs showed that the inducible expression pattern of GhBI-1 was tissue specific. The expression of GhBI-1 in roots is stronger compared with in leaves under ER stress conditions. The overexpression of GhBI-1 increased the TM resistance of transgenic Arabidopsis and delayed cell death mediated by ER stress. The analysis of the expression of bZip60 involved in unfolded protein response showed that GhBI-1 activated the avtivity of bZip60 and improved cell tolerance to ER stress.

Keywords Bax inhibitor-1； Endoplasmic reticulum stress； Cell death； Cotton； Arabidopsis； Tunicamycin

内质网是膜蛋白和分泌蛋白合成新肽链及进行新肽链初步折叠的重要场所。许多不利的环境和生理条件都会干扰内质网腔内蛋白的正常折叠，导致未折叠和错误折叠蛋白在内质网内累积，造成内质网胁迫（endoplasmic reticulum stress， ER stress）[1]。在短期且较温和的ER stress胁迫下，未折叠蛋白反应（unfolded protein response， UPR）调控下游分子伴侣及胁迫基因的表达，恢复未折叠蛋白进行正确折叠，恢复内质网的动态平衡；而在持续且强烈的ER stress胁迫下，UPR触发“死亡信号”，使细胞不可逆地发生程序性细胞死亡（programmed cell death， PCD）[2-4]。PCD是高度保守的受基因控制的重要细胞事件，参与真核细胞的发育、胁迫应答等过程[5]。PCD的发生需要极其精细的调控，在众多的调控因子中，Bax inhibitor-1（BI-1）是抑制细胞死亡发生的关键因子[6]。

BI-1是动植物及真菌中普遍存在且高度保守的细胞死亡抑制因子之一。Xu等最早从人cDNA文库中分离出BI-1基因，BI-1的表达能够阻断由鼠Bax诱发的细胞死亡[7]。在肿瘤细胞系中，过表达人BI-1能够增强细胞对胁迫刺激的耐受性；相反，降低BI-1的表达加速细胞死亡。动物细胞中BI-1调控PCD的机制已解析的比较清楚，在ER stress发生时，BI-1受UPR信号支路IRE1a的调控表达，通过其C末端尾及跨膜区形成离子通道，调节内质网中驻留的Ca2+信号的流动，从而抑制死亡，促进细胞生存[8-10]。

与动物BI-1的研究相比，植物BI-1的研究相对滞后，但进展迅速。目前，已从大麦、辣椒、水稻、拟南芥等植物中分离出BI-1同源基因[11-14]。植物BI-1在不同的组织（叶片、根、茎、花、果实等）中都有表达；在ER stress专一性诱导剂——衣霉素（tunicamycin，TM）诱导下高水平表达，说明植物BI-1可能在缓解ER stress造成的危害中具有重要功能[3]。植物BI-1还具有与动物类似的跨膜结构域，暗示其可能具有与动物BI-1相似的功能，也参与了ER stress诱发的细胞死亡的调控[14，15]。Watanabe等对拟南芥BI-1基因（AtBI-1）缺失的拟南芥突变体（atbi1-1，T-DNA插入敲除突变体）的研究拓宽了人们对BI-1调控ER stress介导的细胞死亡的认识。AtBI-1的缺失使atbi1-1对ER stress更加敏感，加速了PCD的发生；而过表达AtBI-1提高了拟南芥对ER stress的耐受能力，ER stress介导的PCD相应延迟[3]。此外，缺失C端的AtBI-1蛋白不具备调节细胞死亡的功能，说明其带有成簇电荷的C末端是其正常行使功能所必需的结构[8]。

棉花是我国重要的经济作物和战略资源储备，同时也是盐碱地“先锋作物”，其全生长期都面临不利的环境条件。较强的胁迫对棉花生长造成恶劣影响，产量减少、品质降低，严重时甚至导致棉株死亡。因此，深入研究棉花适应及抵御逆境的机制，提高棉花对逆境的适应能力，对恶劣条件下棉花生产的可持续发展具有重要的现实意义。前期工作中，我们对棉花BI-1（GhBI-1）进行了克隆及功能分析，揭示了GhBI-1在植物耐盐中的重要作用[16]。但到目前为止，GhBI-1在ER stress诱发的细胞死亡中的作用尚未见报道。本试验以前期工作为基础，拟分析ER stress下的GhBI-1响应模式。通过评估过表达GhBI-1对转基因拟南芥的ER stress耐受能力及细胞死亡的影响，分析GhBI-1在ER stress及细胞死亡中所起的作用，为进一步研究GhBI-1的抗逆功能及机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

过表达棉花Bax inhibitor-1（GhBI-1）及野生型拟南芥（Columbia ecotype）由本实验室郑玲及霍雪寒同学提供[16，17]。试验所用陆地棉品种为Coker 312。

棉花总RNA的提取使用多糖多酚植物RNA提取试剂盒（华越洋生物科技有限公司）；擬南芥总RNA抽提使用Trizol试剂盒（上海生工）；反转录及实时定量PCR试剂购自TaKaRa；衣霉素（tunicamycin， TM）、台盼蓝试剂购自上海生工。

1.2 棉花GhBI-1基因的TM诱导表达分析

用质量浓度为10 μg/mL的TM溶液处理二叶期棉花幼苗，处理时间为0、4、12、18、24 h。取叶片及根用液氮速冻，-70℃冻存。采用华越洋多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取总RNA，用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以此为模板，用基因特异性引物（GhBI-1-F/R， 表1）进行qRT-PCR。PCR程序为95℃ 5 min； 95℃ 5 s， 60℃ 10 s， 72℃ 10 s， 40个循环。使用Applied Biosystems进行试验和分析。GhBI-1的相对表达量用2-△△Ct方法计算，误差线表示SD（n=3）。

1.3 转GhBI-1基因拟南芥的半定量PCR鉴定

转GhBI-1基因拟南芥的获得见霍雪寒等[16]的方法。转基因拟南芥的纯合后代由本实验室保存。本试验使用其中3个独立转化系，分别为OE1、OE2、OE3。转基因拟南芥播种后置于温室培养，25 d后利用Trizol法提取叶片总RNA，利用TaKaRa反转录试剂盒获得cDNA，以此为模板，利用基因特异引物（GhBI-1-F/R）进行半定量PCR。

1.4 TM胁迫下的拟南芥萌发率分析

将WT和OE系的种子用1%的次氯酸钠溶液表面消毒后，分别播种在含有0、0.1、0.3 μg/mL TM的MS培养基上，4℃放置3 d后移至光照培养箱中，7 d后统计种子萌发率。误差线表示SD（n=3）。

1.5 拟南芥幼苗期的TM抗性分析

WT和OE系种子进行表面灭菌，播种在MS培养基上。当子叶平展且侧根尚未长出时（10 d），将其转移到含有0、0.5 μg/mL TM的固体MS培养基上竖直培养，3周后称量幼苗鲜重，统计测量侧根数目及长度。误差线表示SD（n=3）。

1.6 细胞死亡检测

将苗龄30 d的拟南芥植株的叶片浸泡在2 μg/mL TM溶液中进行暗处理，3 d后将叶片取出，用无菌水冲洗后利用台盼蓝染色法进行细胞死亡检测。将处理后的叶片置于乳酸酚（乳酸、甘油、苯酚、灭菌水等体积混匀）配制的含0.25 mg/mL台盼蓝的染色液中，煮半分钟；冷却后，用脱色液（95%乙醇∶乳酸酚=2∶1）脱色10 min[18]。同时，提取同样处理的0、6 h的叶片总RNA，用qRT-PCR法检测bZip60的相对表达量（方法同1.2，所用引物为bZip60-F/R， 表1）。用2-△△Ct方法计算bZip60的相对表达量，误差线表示SD（n=3）。

2 结果与分析

2.1 棉花GhBI-1基因的TM诱导表达特性

棉花幼苗经TM处理后，利用qRT-PCR检测叶片及根中GhBI-1的诱导表达情况（图1），结果显示，GhBI-1受TM诱导上调表达。与叶GhBI-1的表达相比，根GhBI-1对TM的响应更加强烈。处理12 h后，根GhBI-1的表达量达到最高，为处理前的30倍；此时，叶GhBI-1的表达量为处理前的6.7倍。随着处理时间的延长，根和叶GhBI-1的表达量逐渐回落。上述结果说明GhBI-1响应TM胁迫，在TM诱导下强烈表达。此外，GhBI-1的诱导表达具有组织特异性，根GhBI-1对TM的响应更加强烈。

2.2 过表达GhBI-1提高拟南芥萌发期的TM抗性

首先，利用半定量PCR检测过表达GhBI-1拟南芥（OE1、OE2、OE3）中GhBI-1的表达情况，结果（图2）显示，所检测的3个独立转化系均能够扩增出GhBI-1基因的特异性条带，而野生型对照中未检测到，该结果说明GhBI-1能够在拟南芥中表达。

为研究GhBI-1的功能，分析了过表达GhBI-1对种子萌发率的影响。结果（图3）显示，与胁迫处理前相比，TM处理后的WT和OE系的种子萌发率均降低，说明TM胁迫抑制了种子萌发。不同浓度TM处理下，OE系的萌发率均较WT高。在0.1 μg/mL TM胁迫下，WT的种子萌发率降为79.3%，OE系的萌发率为92.0%～94.0%；在0.3 μg/mL TM胁迫下，OE系的萌发率为69.3%～73.0%，为WT萌发率（41.3%）的1.68～1.76倍。上述结果说明过表达GhBI-1基因提高了拟南芥种子萌发期对TM胁迫的抵抗能力。

2.3 过表达GhBI-1提高拟南芥幼苗期的TM抗性

为进一步研究GhBI-1的功能，进行了苗期TM抗性试验（图4）。将苗龄相同、生长一致的WT和OE系幼苗（苗龄为10 d）转移到含有0.5 μg/mL TM的MS固体培养基上竖直培养，21 d后观察拍照并对鲜重、侧根数及伸长进行测定。结果显示（图4A），幼苗在TM胁迫下出现叶片卷曲、失绿等胁迫表型。与WT相比，OE系的胁迫表型相对较轻。

对胁迫后的幼苗鲜重进行称量，结果显示（图4B），在正常的MS培养基上生长时，WT和OE系幼苗的鲜重基本一致；附加TM后，OE系幼苗的鲜重高于WT，约为WT鲜重的1.6倍。此外，对TM胁迫后幼苗侧根的数目和长度进行统计测量。在未进行TM处理时，WT和OE系的侧根数和长度基本一致，没有显著差别；TM处理后，OE系的侧根发生较WT多，约为WT的2倍（图4C）。相应地，侧根长度也呈现出相似的趋势。未进行TM处理时，WT和OE系的侧根长度均为120 mm左右，没有明显的差别；TM处理后，OE系的侧根长度约为WT的2.5倍（图4D）。上述结果说明，过表达GhBI-1提高了拟南芥幼苗期的TM抗性。

2.4 过表达GhBI-1抑制ER-stress诱导的细胞死亡

为研究GhBI-1提高TM抗性的机制，检测了TM胁迫后的细胞死亡情况以及bZip60的表达情况。结果（图5）显示，TM处理后，WT和OE系叶片均有不同程度的染色，TM处理造成ER stress诱发细胞死亡。与WT相比，OE系叶片的台盼蓝染色面积较小，相对分散，染色较浅。此外，利用qRT-PCR检测了bZip60的表达变化。结果（图6）显示，TM处理前，bZip60的表达水平较低，TM胁迫6 h后，bZip60的表达水平显著提高。与WT相比，OE系中bZip60的表达水平较高。处理6 h时，OE系中bZip60的表达量约提高了6.9倍，而WT中bZip60的表达量提高了2.3倍。以上结果表明，GhBI-1激活了UPR信号通路关键基因bZip60的表达，减轻了TM引起的ER stress，减缓了细胞死亡的发生。

3 讨论与结论

蛋白质参与生命代谢、信号传递、生长发育等各个方面，其合成、折叠、转运需要精确的调控。新肽链的折叠及修饰非常复杂，极易受到细胞环境的影响[19，20]。任何环境胁迫和生理胁迫都有可能导致新肽链的错误折叠，影响内质网的稳态，造成ER stress。ER stress激活UPR反应， 启动分子伴侣及胁迫相关基因的表达，帮助细胞应对胁迫环境。目前，ER stress及UPR的相关研究逐渐成为植物耐逆领域的热点问题。

TM是一种蛋白质N-糖基化作用抑制剂，目前被广泛应用在ER stress相关的研究中[21-23]。本试验利用TM对棉花幼苗进行处理，分析GhBI-1对TM诱导的响应情况。GhBI-1受TM诱导表达，但在根和叶中的响应模式不同。根GhBI-1基因的TM诱导表达非常强烈，处理12 h时，表达量高达处理前的30倍。叶GhBI-1对TM的响应较弱，处理12 h时，表达量为处理前的6.7倍（最高值），说明GhBI-1的诱导表达在不同组织中有差异。此外，拟南芥TM抗性检测也呈现出类似的结果，OE系根对TM抗性的提高较为明显。Ruberti等的研究结果也表明，AtBI-1对bZip28转录因子活性的影响在根和叶中不同[21]。

當ER stress持续发生时，UPR不仅诱导胁迫基因及分子伴侣基因的表达，帮助未折叠或错误折叠蛋白进行折叠，同时，还能发出“促死亡”信号，诱发细胞死亡[24，25]，例如，拟南芥的根在TM持续胁迫时会发生PCD [6，26]。AtBI-1沉默后，突变体对TM的敏感性提高，更易发生细胞死亡。在本研究中，我们在利用TM长时间处理拟南芥叶片后发现，长期的ER stress诱发叶片细胞发生死亡。GhBI-1的过表达抑制了细胞死亡的发生，这与AtBI-1的报道是一致的，GhBI-1可能具有与AtBI-1相似的抗细胞死亡的功能。

植物UPR主要有2条信号通路，一条是由bZip28转录因子介导的通路，另一条由bZip60转录因子介导的通路[27，28]。在持续ER stress下，拟南芥bZip28和bZip60的双突变体是致死的[29]，说明bZip28/bZip60的活性在“促生存”信号通路中具有极其重要的作用。在本研究中，持续的ER stress 条件下，过表达GhBI-1使拟南芥对ER stress的耐受性提高，细胞死亡减缓，同时，bZip60的表达水平提高，推测GhBI-1可能是通过激活bZip60信号通路，减缓了ER stress介导的细胞死亡。综上，GhBI-1受TM诱导表达，且其表达具有组织特异性。过表达GhBI-1提高拟南芥的TM抗性，缓解ER stress造成的毒害，推迟细胞死亡的发生，说明GhBI-1具有抑制ER stress介导的细胞死亡的功能。

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