水稻类受体蛋白激酶FTPK1的原核表达及其活性检测

李颖秀 李臻 潘教文 王庆国 刘炜

摘要：类受体蛋白激酶（receptor-like kinase， RLKs）是植物信号分子的受体，它能够通过胞内激酶域对底物进行磷酸化或去磷酸化，从而对下游靶基因的转录及表达进行调控，参与胞内信号转导，在植物生长发育及环境应答过程中发挥作用。本研究以水稻“中花11”cDNA为模板，通过PCR技术获得类受体蛋白激酶基因FTPK1的全长序列，进一步构建原核表达载体pET-28a-FTPK1后，经1 mmol/L IPTG诱导12 h，获得88 kD的诱导表达蛋白条带，显示FTPK1可在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经Ni柱纯化及透析后，获得纯化的融合蛋白。FTPK1激酶活力检测显示，其可磷酸化蛋白底物His和MBP，具有一定的磷酸化活性。本研究为进一步制备FTPK1特异性抗体，深入解析其理化特性及生物学功能奠定了基础。

关键词：水稻；类受体蛋白激酶；FTPK1；原核表达；蛋白纯化；激酶活力检测

中图分类号：S511.0353文獻标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0007-07

Abstract Receptor-like protein kinases （RLKs） are receptors of signaling molecules of plants. It can be phosphorylated or dephosphorylated through the intracellular kinase domain， thus regulating the transcription and expression of downstream target gene， participating in the intracellular signal transduction， and playing a role in plant growth and environmental response. In this study， the cDNA of rice variety Zhonghua 11 was used as template to obtain the full-length sequence of FTPK1 gene by PCR， and the pET-28a-FTPK1 prokaryotic expression vector was constructed. An 88 kD fusion protein could be induced by 1 mmol/L IPTG for 12 hours， indicating that FTPK1 could be induced in E. coli. The purified protein product of FTPK1 could be obtained after purification and dialysis by Ni column. The detection of protein kinase activity showed that FTPK1 could phosphorylate the substrates of His and MBP， which showed that FTPK1 has phosphorylation activity. This research shed some lights for further preparation of the FTPK1 specific antibody， and lay solid foundation for analysis the physical and biochemical functions of FTPK1.

Keywords Rice； Receptor-like protein kinase； FTPK1； Prokaryotic expression； Protein purification； Kinase activity detection

所有生命体在细胞水平上都是通过各种受体接收和处理信息来维持机体的正常生命活动，这些受体不仅能够识别来自环境和临近细胞的信号，还能够激活其下游的信号级联途径。在动物中，典型的一类受体是受体激酶（receptor kinases，RKs）。RKs有一个能够专一性识别配基的胞外结构域，其通过一个跨膜结构域连接着一个胞内激酶区。其激活过程依赖于磷酸化[1]。

植物类受体蛋白激酶（receptor-like kinases，RLKs）的结构类似于动物RKs[2-4]。由一个胞外区、一个跨膜区和一个包含近膜区、激酶区和羧基端的胞内域构成，通过胞外区与胞外信号分子特异结合来激活胞内激酶区的磷酸化，完成跨膜信号转导的功能。研究证明大部分RLKs都能发生自体磷酸化，这对于它本身的功能具有极其重要的作用，例如，芸苔属SRK是自交不亲和性受体，它是雌蕊一方的重要因子，只有当雌蕊和不亲和性花粉进行相互识别，才能引发受体的自磷酸化[5]。生物化学分析方法揭示抗性蛋白Xa21的胞内近膜区的丝氨酸686、苏氨酸688和丝氨酸689均能发生自磷酸化，但用丙氨酸取代这些氨基酸后，可使Xa21蛋白不稳定，从而弱化了Xa21介导的抗病性，但不影响激酶区的自磷酸化[6]。最近，有研究者发现Xa21近膜区的苏氨酸75在Xa21的自磷酸化和先天免疫中发挥关键作用，将其突变为丙氨酸后，则激酶区丧失了自磷酸化活性，Xa21的抗病功能明显降低[7]。这些研究表明，激酶活性在类受体激酶行使生物学功能的过程中是必须的，植物RLKs的信号转导过程与动物中激酶的转导方式相似，均需借助于磷酸化与自磷酸化。

Pro-Q Diamond dye 是 Molecular Probes 公司开发的一种荧光染色试剂，主要用于信号转导中蛋白磷酸化的研究，可以直接对磷酸化蛋白凝胶进行染色，检测磷酸化位点中的酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸的磷酸化而无需加入抗体，同时该染料还与质谱兼容，且不妨碍随后蛋白质组中多种磷酸化分析研究[8]。Pro-Q Diamond dye对于不同的磷酸化位点，灵敏度差异较大，对高丰度且磷酸基团转化速率低的蛋白质具有较高的灵敏度。Orsatti等[9]联合运用二维电泳和 Pro-Q Diamond dye 染色方法，以过度表达蛋白酪氨酸磷酸酶 PRL-3 的高度侵袭性结肠癌细胞 HCT116 为模型，通过 Pro-Q Diamond dye 检验芯片，成功检测出 PRL-3 的两种目标蛋白——细胞骨架蛋白 ezrin 和延伸因子2 有明显的去磷酸化。Liu等[10]应用双向凝胶电泳和 Pro-Q Diamond dye染色技术对人体张氏肝脏细胞总蛋白进行了分离，结果共鉴定出 269个磷酸化蛋白。据此，Liu等推测，双向凝胶电泳结合 Pro-Q Diamond dye 染色方法可以检测全部磷酸化蛋白。Ding等分析了运动对大鼠海马区能量代谢和神经可塑性相关蛋白的影响[11]。Schulenberg等应用蔗糖密度梯度分离和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，通过 Pro-Q Diamond dye分析了牛心脏线粒体蛋白磷酸化稳态，成功得到肽质量指纹图谱，并能区分相同磷酸多肽不同亚型之间的磷酸化[12]。

本研究结合基因序列信息分离到一个水稻发育相关的类受体蛋白激酶，命名为Flower Time Protein Kinase 1（FTPK1），通过构建水稻FTPK1基因的融合蛋白表达载体pET-28a-FTPK1，并将其转化到大肠杆菌中诱导蛋白表达，经透析纯化，对蛋白产物进行激酶活力检测验证其磷酸化活性。该研究有利于进一步解析激酶FTPK1的生理生化特性及生物学功能，为进一步完善类受体蛋白激酶的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以水稻“中花11”为材料。TransTaq DNA Polymerase High Fidelity （HiFi）试剂盒、T4 DNA Ligase试剂盒、2×EasyTaq Super Mix及Trans 2K Plus DNA Marker均购于Transgen公司（山东济南雨同生物科技有限公司），PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、pMD18-T Vector试剂盒、pET-28a载体及DL5000 DNA Marker均购于TaKaRa公司，纯质粒小量制备试剂盒购于BioTeke公司（济南承森贸易有限公司），薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于GENERAY Biotech，引物由上海英潍捷基公司合成，其余试剂为进口或国产分析纯。

1.2 水稻幼苗RNA的提取及单链cDNA的获得

取培养2周的水稻幼苗，按TransZol Plant试剂盒说明书提供的方法提取水稻RNA，并参照PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书将所得水稻RNA反转录成单链cDNA。

1.3 FTPK1的克隆

根据FTPK1基因序列（NCBI登录号：XM_015763263.1），使用Primer Premier 5.0设计引物FTPK1S8：5′CCGGATCCATGCCGAAATCTAAATCATTCGTC3′，FTPK1A5：5′CCGTCGACGGTAAACAGGCGACAGGGACATGG3′（下划线分别为BamHⅠ、 SalⅠ酶切位点），以水稻幼苗cDNA为模板，PCR反应体系为：2×EasyTaq Super Mix 10 μL、引物FTPK1S8及引物FTPK1A5各0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O补齐到20 μL。反应程序设置如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，35个循环；72℃ 10 min。

1.4 FTPK1原核表达载体的构建

将经PCR扩增得到的FTPK1片段回收纯化，与pMD18-T载体用T4 DNA连接酶于22℃连接30 min，转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，均匀涂于100 mg/L Amp抗性LB平板，于37℃倒置过夜培养。对构建的中间表达载体，挑取单克隆经菌落PCR鉴定后，送至山东省农业科学院生物技术研究中心测序室测序。使用BamHⅠ、SalⅠ分别酶切测序正确的pMD18-T-FTPK1质粒及原核表达载体pET-28a，回收纯化酶切片段，用T4 DNA连接酶22℃连接30 min，转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，酶切检测。选择鉴定正确的pET-28a-FTPK1质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，均匀涂于100 mg/L Kan抗性LB平板37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经PCR鉴定，获得阳性菌株，鉴定为阴性的菌株为对照。

1.5 FTPK1融合蛋白诱导表达条件的优化及SDS-PAGE鉴定

分别将含有重组质粒pET-28a-FTPK1的BL21（DE3）菌株及阴性对照菌株于37℃振荡培养，菌液按1∶50用液体LB培养基稀释，培养至OD600≈0.6，加入IPTG（终浓度为1 mmol/L）于20℃培养箱诱导12 h，转速分别为120、140、160 r/min。收集菌液经超声波破碎后，5 000 r/min离心10 min，分别取破碎菌液、上清、沉淀进行12% SDS-PAGE电泳，经染色、脱色后观察并记录。

1.6 FTPK1融合蛋白纯化

根据优化好的诱导条件，500 mL大量摇菌，蛋白经IPTG诱导过夜后6 000 r/min离心10 min收集菌体。加入40 mL起始缓冲液重悬菌体，加入5 μg溶菌酶37℃水浴1 h，于-80℃放置至少1 h后30℃水浴解冻，超声波破碎1 h（每10 s破碎一次，每次破碎5 s）后，9 000 r/min离心10 min，取上清用于蛋白纯化。Ni-Trap柱与0.45 μm过滤器连接好，注射器取5 mL灭菌水注入镍柱中缓慢排除柱内乙醇，取3～5 mL 0.1 mol/L硫酸镍注入柱中，用5 mL去离子水清洗掉未结合的镍离子，然后用5 mL起始缓冲液洗柱平衡，将20 mL蛋白上清分次缓慢注入镍柱，用5 mL起始缓冲液洗柱，再用8 mL冲洗缓冲液洗柱，最后用5 mL洗脱缓冲液溶解并洗脱目的蛋白，将蛋白洗脱液置于1.5 mL EP管中，每管约500 μL，弃第一管，共收集3管，放于-80℃保存备用。

1.7 纯化蛋白的透析及浓度检测

配置1 L的透析液（50 mmol/L磷酸缓冲液、0.1 mmol/L EDTA、5 mmol/L β-巯基乙醇、5%甘油）于大烧杯中，放入含有上一步纯化的蛋白的密封透析袋，使之跟随转子缓慢旋转。期间每隔6 h更换一遍透析液，约20 h后透析完成，将透析好的蛋白吸取到1.5 mL EP管中，经考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，放于-80℃备用。

1.8 荧光染色法检验蛋白的磷酸激酶活性

1.8.1 激酶反应 激酶反应体系为30 μL，每个反应需2 μg蛋白，30℃反应1 h。本试验用150 μL的反应体系，每个反应用10 μg蛋白（表1）。设置5个反应体系，所加蛋白种类及用量如表2所示，各反应30℃放置1 h后加入600 μL甲醇，混匀后加入150 μL氯仿，12 000 r/min离心5 min；弃上清后加入450 μL甲醇，混匀后12 000 r/min离心5 min；弃上清后在真空干燥箱中放置10 min； 每管用40 μL 1× protein loading buffer回溶，開盖煮沸5 min 后冰浴10 min，进行SDS-PAGE电泳。

1.8.2 凝胶染色 将蛋白胶置于100 mL固定液（甲醇100 mL、冰醋酸20 mL、超纯水80 mL），40 min后更换固定液过夜，反应均在50 r/min、28℃的培养箱进行；超纯水清洗3次，每次加100 mL，每隔10 min换一次；将水倒掉，之后避光操作，加入100 mL Pro-Q Diamond phosphoprotein gel stain染剂，染色1.5 h；倒掉染色液，加入100 mL脱色液（乙腈200 mL、1 mol/L乙酸钠50 mL、超纯水750 mL），每隔30 min更换一次，共换3次；超纯水100 mL冲洗两次，每次5 min；凝胶成像仪观察并记录染色结果。

2 结果与分析

2.1 FTPK1基因的克隆

借助PCR技术，扩增FTPK1基因，得到一条长2 343 bp的条带，与预测基因大小一致，为目的条带（图1）。

2.2 FTPK1原核表达载体的构建

使用BamHⅠ、SalⅠ双酶切pMD18-T-FTPK1质粒（图2），回收纯化FTPK1片段，定向连入pET-28a中，转化大肠杆菌Trans5α菌株，酶切验证，得到预期大小片段。转化大肠杆菌BL21（DE3）进一步PCR鉴定，筛选阳性克隆（图3），获得FTPK1的原核表达载体pET-28a-FTPK1（图4）。

2.3 FTPK1融合蛋白诱导表达

含有重组质粒pET-28a-FTPK1的BL21（DE3）菌株经1 mmol/L IPTG于20℃培养箱诱导12 h，转速分别为120、140、160 r/min，超声波破碎后经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳胶检测，如图5所示，与对照相比，在70～100 kD之间有一条特异的蛋白条带，其大小与预测蛋白大小相吻合，约为88 kD。而且比较几个不同转速下诱导表达的蛋白条带可知，在转速为120 r/min时蛋白的表达量无论在上清还是沉淀中都是最高的，所以将1 mmol/L IPTG于120 r/min、20℃诱导12 h作为最佳诱导条件，用于之后蛋白的诱导纯化过程。

M：Blue Plus Ⅱ Potein Marker；1、5分别为含pET-28a空载菌株120 r/min诱导12 h后的上清和沉淀；2—4、6—8分别为含pET-28a-FTPK1菌株120、140、160 r/min诱导12 h后的上清及沉淀。

2.4 FTPK1融合蛋白纯化及透析

pET-28a质粒上含有一个His标签，融合蛋白pET-28a-FTPK1经超声波破碎后过Ni柱纯化，含有His标签的蛋白与氯化镍结合，用含有咪唑的洗脱液洗脱，咪唑与蛋白争夺结合位点，从而使蛋白洗脱下来。经Ni柱纯化的蛋白还会含有分子量小于目的蛋白的片段，经透析液透析，最终得到约88 kD大小的与目的蛋白片段大小相近的蛋白产物 （图6），保存于超低温冰箱备用。

2.5 FTPK1融合蛋白磷酸激酶活性检测

MBP和His是激酶的蛋白底物，若激酶与蛋白底物进行反应后的荧光染色结果比自身强，则说明该激酶具有磷酸化活性，能够磷酸化蛋白底物。如图7所示，FTPK1融合蛋白与蛋白底物MBP、His进行激酶反应后，经荧光染料Pro-Q Diamond phosphoprotein gel stain染色，结果显示与激酶反应后的蛋白底物条带与单独的蛋白底物条带相比有较明显加深（右图第2～5泳道下方条带），这说明FTPK1融合蛋白具有磷酸化活性。

3 讨论与结论

在动物中，受体激酶主要分为受体酪氨酸激酶和丝/苏氨酸激酶[13]，其中，最被人熟知的丝/苏氨酸激酶是转化生长因子-β受体复合物，由两个不同的受体形成的异构复合物。Ⅱ型受体为能够结合配基，促进Ⅰ型受体磷酸化。在Ⅱ型受体不存在时，Ⅰ型受体不能单独结合配体。Ⅰ型受体磷酸化后能够将信号向下游传导[14]。受体酪氨酸激酶是通过配基激活同源二聚体或者由两个相关的受体酪氨酸激酶形成的异源二聚体来发挥作用。激酶域的活化区自磷酸化激活自身激酶的活性，使得磷酸化的酪氨酸成为招募下游信号途径组分的衔接位点，或者激活下游信号级联途径[15]。

目前，在植物中RLKs的功能尚不清楚，因其结构与与动物RKs结构类似，推测其在植物中也有类似功能。Trotochaud和Gmez-Gmez等對两个受体的突变体进行分析，一个是参与顶端分生组织发育的CLV1，另一个是参与病原引起的防卫反应的FLS2，试验证明突变后的CLV1和FLS2不能与各自的配基CLV3和鞭毛蛋白相互作用[16，17]，推测激酶自身具有磷酸化活性可能是该激酶能够与其配基结合的必要条件 。

本研究利用pET系统构建了FTPK1的原核表达载体pET-28a-FTPK1，参考实验室前期研究[18，19]，分别经不同浓度IPTG在不同温度不同转速的情况下诱导12 h后进行SDS-PAGE蛋白电泳，经观察比较，筛选到合适的蛋白诱导条件，即1 mmol/L IPTG于120 r/min、20℃培养箱诱导12 h。蛋白纯化后凝胶检测发现仍有两条蛋白杂带，猜测其原因可能有两个，一是蛋白较大，在诱导过程中会合成不完整的蛋白片段，因其大小与目标蛋白相似且同样带有His标签，所以在Ni柱纯化时也会被结合并洗脱下来；第二个可能原因是与蛋白相互作用较强的蛋白因不易与其分离，也被洗脱下来。此外，观察对比FTPK1的磷酸激酶活性检测结果可知，底物MBP和His的确被其磷酸化而使荧光染料染色加深，但结果并不十分理想，猜测可能原因是设备条件及人为操作等因素在蛋白纯化及透析过程中对蛋白造成的损伤较大，使蛋白活力受到一定影响，从而导致蛋白磷酸化活性下降。

蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要内容，在酶和其它重要功能分子活性的发挥、第二信使传递和酶的级联作用中起到重要的作用。蛋白质的磷酸化主要集中在肽链中的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基上，这些残基上具有游离的羟基，且本身不带电荷，当磷酸化作用后，蛋白质便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化，这也是蛋白质磷酸化的意义所在。本研究通过对FTPK1融合蛋白表达载体的构建，蛋白诱导表达、纯化及激酶活性检测来验证该激酶的磷酸化活性，为进一步研究该类激酶的功能奠定了基础。

参 考 文 献：

[1] Pawson T， Nash P. Protein-protein interaction define specificity in signal transduction[J]. Genes Dev.， 2000，14（9）：1027-1047.

[2] Shiu S H， Bleecker A B. Plant receptor-like kinase gene family： diversity， function， and signaling [J]. Sci. STKE， 2001， 113：1-14.

[3] Cock J M， Vanoosthuyse V， Gaude T. Receptor kinase signaling in plants and animals： distinct molecular systems with mechanistic similarities [J]. Curr. Opin. Cell. Biol.， 2002，14（2）：230-236.

[4] Morris E R， Walker J C. Receptor-like protein kinases： the keys to response[J]. Curr. Opin. Plant Biol.，2003， 6（4）： 339-342.

[5] Cabrillac D， Cock J M， Dumas C， et al. The S-locus receptor kinase is inhibited by thioredoxins and activated by pollen coat proteins [J]. Nature， 2001，410（6825）： 220-223.

[6] Xu W H， Wang Y S， Liu G Z， et al. The autophosphorylated Ser686，Thr688， and Ser689 residues in the intracellular juxtamembrane domain of XA21 are implicated in stability control of rice receptor-like kinase [J]. Plant J.， 2006， 45（5）： 740-751.

[7] Chen X W， Chern M， Canlas P E， et al. A conserved threonine residue in the juxtamembrane domain of the XA21 pattern recognition receptor is critical for kinase autophosphorylation and XA21-mediated immunity [J]. J. Biol. Chem.， 2010， 285（14）： 10454-10463.

[8] Bockus L B，Scofield R H.Phosphoprotein detection on protein electroblot using a phosphate-specific fluorophore[J].Methods Mol.Biol.，2009，536：385-393.

[9] Orsatti L，Forte E，Tomei L，et al.2-D Difference in gel electrophoresis combined with Pro-Q Diamond staining：a successful approach for the identification of kinase/phosphatase targets[J].Electrophoresis，2009，30（14）：2469-2476.

[10]Liu J，Cai Y，Wang J，et al.Phosphoproteome profile of human liver Changs cell based on 2-DE with fluorescence staining and MALDI-TOF/TOF-MS[J].Electrophoresis，2007，28（23）：4348-4358.

[11]Ding Q，Vaynman S，Souda P，et al.Exercise affects energy metabolism and neural plasticity-related proteins in the hippocampus as revealed by proteomic analysis[J].Eur.J.Neurosci.，2006，24（5）：1265-1276.

[12]Schulenberg B，Aggeler R，Beechem J M， et al.Analysis of steady-state protein phosphorylation in mitochondria using a novel fluorescent phosphosensor dye[J].J.Biol.Chem.，2003，278（29）：27251-27255.

[13]Hunter P. Protein kinase classication [J]. Methods Enzymol.， 1991，200： 3-38.

[14]Massague J. TGF-beta signal transduction [J]. Annual Review of Biochemistry， 1998， 67： 753-791.

[15]UIrich A， Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity [J]. Cell， 1990， 61（2）： 203-212.

[16]Trotochaud A E， Hao T， Wu G， et al. The CLAVATAI receptor-like kinase requires CLAVATA3 for its assembly into a signaling complex that includes KAPP and a Rho-related protein [J].The Plant Cell， 1999， 11（3）： 393-406.

[17]Gmez-Gmez L， Boner T. FLS2： an LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis[J]. Molecular Cell， 2000， 5（6）： 1003-1011.

[18]趙丽， 张国嘉， 刘炜，等. 水稻类受体蛋白激酶OsESG1的原核表达[J]. 山东农业科学， 2015， 47（1）： 1-5.

[19]王一帆， 潘教文， 刘炜，等. 谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35的克隆及原核表达[J]. 山东农业科学， 2016，48（9）：1-5.