TIMP-2基因多态性与宫颈癌发病风险的相关性

张晓兴，王家建

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，病死率占总癌症死亡率的第四位，严重危害妇女的身心健康[1]。人乳头瘤病毒感染被认为是引起宫颈癌的主要原因之一[2]。近年来研究者们热衷于研究基因多态性与宫颈癌易感性的研究[3]，以期从基因层面解释宫颈癌的发病机制。基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP-2）是基质金属蛋白（MMP）的天然特异性抑制因子，它能够与相应的基质金属蛋白酶结合来共同维持基质内环境的稳定与结构完整性[4]，TIMP-2是机体内主要的内源性抑制剂。本研究采用病例-对照的研究方法，通过Mass ARRAY基因分型的方法检测 TIMP-2基因上的多态性位点，通过统计学相关方法分析其位点多态性与宫颈癌患病风险之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年6月至2016年8月浙江省湖州市妇幼保健院妇产科收治的宫颈癌患者280例为病例组，入选条件：（1）所有患者均经临床诊断确诊为宫颈癌患者；（2）未经过放射治疗和化学治疗；（3）精神状况良好；（4）研究对象之间无直接亲属关系。对照组为年龄、性别及种族匹配的同时期在本院检验科进行体检的300例健康人群，入选条件：（1）既往无肿瘤病史、慢性疾病、严重代谢性疾病及内分泌失调等；（2）精神状况良好；（3）研究对象之间无直接亲属关系。本研究已获得所有研究对象的知情同意，符合伦理学的各项规定。

1.2 试剂与仪器 全血基因组纯化试剂盒（美国Thermo Fisher公司），iPLEX Gold试剂盒（美国Sequenom公司）；MassARRAY质谱仪（美国Sequenom公司），GeneAmp9700 PCR仪（美国ABI公司）。

1.3 血样采集及DNA提取 采集每位研究对象外周静脉血5ml，置于EDTA抗凝管中，现场编号并登记姓名，所有标本采集当天送回实验室，置于―70℃冰箱保存，以备DNA提取。采用全血DNA纯化试剂盒进行DNA提取，操作步骤严格按照说明书进行。

1.4 基因分型 从NCBI和HapMap数据库中查询TIMP-2基因的多态性位点，选择在CHB人群最小等位基因频率≥5%的位点，最终确定了TIMP-2基因上的TIMP-2-418G/C和TIMP-2+853G/Al两个多态性位点作为本研究中的研究位点。选择单核苷酸多态性（SNP）位点，采用Sequenom MassARRAY SNP基因分型技术对其进行分型。单碱基延伸引物委托上海生工生物工程技术服务公司进行设计和合成。反应在MassArray质谱仪中进行，基因分型使用Sequenom MassARRAY RS1000软件进行。

1.5 统计方法 应用 SPSS 21.0软件进行统计分析。采用精确检验对对照组进行Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验，评估对照组的可靠性。计算各位点的等位基因及基因型频数，采用2检验比较两组间各位点的等位基因频率分布差异是否有统计学意义，初步确定检测的位点是否与宫颈癌患病风险相关。应用 SNP Stats在线软件（http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm）测定各个 SNP位点基因型与宫颈癌患病风险。以相对优势比（）和95%可信区间（）来评估SNP与宫颈癌患病风险的关系。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验结果TIMP-2-418G/C和TIMP-2+853G/A多态性位点的基因型及等位基因频率分布如表1和表2所示。经Hardy-Weinberg平衡检验，发现病例组和对照组人群的基因型频率分布均符合该定律（＞0.05），说明选择的样本具有代表性。

2.2 TIMP-2基因多态性位点的基因型及等位基因频率分布 TIMP-2-418G/C多态性位点的等位基因频率分布在病例组和对照组差异无统计学意义（＞0.05），而基因型频率差异有统计学意义（2＝12.028=0.002）；TIMP2+853A/G 位点的基因型和等位基因频率分布在病例组和对照组差异均有统计学意义（均＜0.01），且病例组等位基因G频率分布明显高于对照组。见表1～2。

2.3 TIMP-2基因多态性与宫颈癌发病风险的关联分析 在等位基因模型下，TIMP-2-418G/C多态性与宫颈癌的患病风险均不存在相关性（均＞0.05）；等位基因模型下，TIMP-2+853G/A多态性位点的G等位基因与宫颈癌存在相关性（＜0.05），C等位基因与宫颈癌的患病风险不存在相关性（＞ 0.05）。见表3。

2.4 TIMP-2基因多态性位点在不同遗传模型下与宫颈癌的相关性分析 通过无条件逻辑回归模型，引入三种遗传模型（显性、隐性和加性），分别计算各位点等位基因的和95%，衡量各位点风险等位基因对宫颈癌患病风险的效应大小，并按照性别、年龄修正。结果显示在显性模型下，TIMP-2+853G/A多态性位点的最小等位基因G与增加宫颈癌患病风险具有相关性（=0.045）；TIMP-2－418G/C多态性位点在三种遗传模型下都与宫颈癌的患病风险无关（＞0.05）。见表4。

3 讨论

表1 TIMP-2基因-418位点基因型频率及等位基因频率分布 例（%）

表2 TIMP-2基因+853位点基因型频率及等位基因频率分布 例（%）

表3 TIMP-2基因多态性与宫颈癌发病风险的关联 例（%）

本研究通过病例-对照的研究设计，利用Mass ARRAY技术检测TIMP-2基因的TIMP-2-418G/C与TIMP-2+853G/A多态性位点，并分析该基因的多态性位点与宫颈癌患病风险的相关性。结果显示：TIMP2+853A/G多态性位点的基因型和等位基因频率分布在病例组和对照组差异有统计学意义，病例组等位基因G频率分布明显高于对照组，显著增加宫颈癌的患病风险（=0.045）。通过各位点的基因型频率比较发现TIMP-2+853G/A多态性位点的G/G基因型频率在病例和对照组差异有统计学意义，能显著增加宫颈癌的患病风险（=0.035）。此外，研究中没有发现TIMP-2-418G/C多态性位点与宫颈癌的患病风险之间的相关性（＞ 0.05）。

TIMPs（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4）是MMPs主要的天然内源性抑制剂，TIMP-2可以抑制任意一种MMPs特异性结合，是一种相对分子量为21kd的非糖基化蛋白,含有192个氨基酸[5]。近年来，许多关于基因调控的实验进一步证实了MMPs与TIMPs比例失衡在肿瘤发生发展中所起重要作用[6]。有研究表明 TIMP2分子在宫颈癌组织中的表达与组织分化程度和淋巴转移密切相关[7-8]。本研究结果显示TIMP2+853A/G多态性位点的基因型和等位基因频率在病例组和对照组的分布具有显著性差异，能显著增加宫颈癌的患病风险（=2.35，95%1.24～ 3.15=0.035）。

综上所述，本研究结果表明TIMP-2基因多态性与宫颈癌患病风险之间存在相关性，表明TIMP-2基因多态性在宫颈癌的发生、发展中可能起着重要的作用。虽然本研究发现了TIMP-2基因上与宫颈癌患病风险相关的多态性位点，但本研究样本量相对较少。因此，在后续的研究中我们仍然需要进一步在大量人群中去验证这些多态性位点及其与宫颈癌患病风险的相关性；而且没有进行候选SNP位点的功能学研究，所以在后续的研究中还需用功能实验证候选基因与宫颈癌的相关性；最后，也需要在不同的人群中去验证这些多态性位点，以期为宫颈癌的临床诊断及治疗提供依据。

表4 各个遗传模型下候选SNP对宫颈癌患病的风险系数