超高效液相色谱-串联质谱法同时测定辣条中的5种罂粟碱

花露,叶平,陆杰,黄银波,马红,王爱霞

(泰州市产品质量监督检验院，江苏 泰州 225300)

调味面制品俗称“辣条”，近年来受到大家的热烈追捧，网络上甚至出现 “吃根辣条压压惊”的流行语。青少年儿童特别是中小学生是主要消费群体[1]。近期有关火锅底料、调味料中检出罂粟碱的新闻报道层出不穷。周围不少家长反映孩子特别喜欢吃辣条，吃了还要吃，不免让人担心不法商家为了达到让顾客上瘾的目的，向其中添加违禁品罂粟壳。罂粟壳为植物罂粟干燥成熟的果壳，主要成分为罂粟碱、那可丁、吗啡、蒂巴因、可待因，具有敛肺、涩肠、止痛的功效[2]。但若经常大量食用含罂粟碱的食品可能会造成人体消化系统、精神系统的损伤，危害消费者的身体健康。国家药品监督管理局、卫生部以及公安部的相关法规都明令禁止在食品中非法添加罂粟壳。

目前测定罂粟碱的方法尚无国家标准，已经报道的检测方法主要有薄层色谱分析法[3,4]、酶联免疫法(ELISA)[5,6]、示波极谱法[7]、气相色谱法[8]、气相色谱-质谱联用法[9,10]、高效液相色谱法和液相色谱-质谱法[11-19]。辣条属于调味面制品，其中添加了各种调味料、防腐剂、色素等，成分复杂，对微量生物碱的准确测定有很大干扰，但是辣条中罂粟碱的检测还暂未有人报道，因此建立辣条中罂粟碱的测定方法十分有必要。因此，本研究建立了辣条中5种罂粟碱(吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁)的超高效液相色谱-串联质谱的分析检测方法，供相关监管部门进行参考。

1 试验部分

1.1 仪器和试剂

超高效液相色谱-串联质谱/质谱仪(UPLC-Quattro Premier XE)、色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm) 美国Waters公司；离心机 北京雷勃尔医疗器械有限公司；涡旋混匀器 德国IKA公司；超声器 Elmasonic S100H公司；电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；固相萃取柱MCX(150 mg/6 mL) 上海安谱公司。

罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因混合标准溶液：来自上海安谱公司。

实验室超纯水：由Milli-Q纯水设备制备；甲醇、乙腈、正己烷、HPLC级试剂，Dikma公司；乙酸、乙酸铵：HPLC级试剂，上海安谱公司；氨水、盐酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验样品：从泰州市苏果、大润发等5家超市、5家农贸市场以及郊区中小学周边的商店随机购买辣条样品共计30份，标签标示中不含有罂粟壳生物碱。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min;进样量：5 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为10 mmol/L乙酸铵水溶液(pH 5.5)，B为0.1%乙酸乙腈，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱表

1.2.2 质谱条件

离子源：正离子模式(ESI+);离子化方式：电喷雾电离；毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流量：500 L/h;锥孔反吹气流量：50 L/h，质谱条件参数见表2。

1.3 试验方法

1.3.1 提取

称取2 g(精确至0.01 g)均质样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL 0.1 mol/L盐酸，振摇混匀，超声提取10 min，然后于离心机5000 r/min离心5 min，将上清液收集于另一50 mL具塞离心管中，再加入10 mL 0.1 mol/L盐酸重复上述步骤，合并2次上清液，加入10 mL正己烷涡旋30 s，然后于5000 r/min离心5 min，弃去正己烷层待净化。

1.3.2 净化

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化固相萃取柱，将提取液以2～3 mL/min的速度载入已活化好的MCX小柱，用5 mL水和50%(V/V)甲醇淋洗，弃去全部流出液，减压抽干5 min以上。然后用8 mL 5%(V/V)氨化甲醇洗脱，收集洗脱液于15 mL离心管中，氮气吹干后准确加入甲醇溶解并定容至1 mL，过0.22 μm滤膜后待测。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

以0.1%乙酸水-乙腈为流动相，考察了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC HSS T3(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH HILIC (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)3种不同的高效液相色谱柱对各组分分离效果的影响。结果表明：在ACQUITY UPLC HSS T3(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)色谱柱上得到的分离效果和峰形较好。

2.1.2 流动相的选择

以HSS T3为色谱柱，以0.1%乙酸水为流动相A，考察了乙腈和0.1%乙酸乙腈作为流动相B对色谱行为的影响，见图1和图2。

图1 0.1%乙酸水-乙腈总离子流图

图2 0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈总离子流图

对比发现图2中吗啡和可待因的峰形得到明显改善，因此以0.1%乙酸乙腈作为流动相B 。结合文献[12,13]，乙酸铵可以作为流动相之一，我们通过改变乙酸铵的酸碱度来考察对色谱行为的影响。结果发现pH 3.5,4.5,5.5时各组分的保留时间和灵敏度都有较大差别，结果见图3～图5。

图3 乙酸铵pH 3.5的总离子流图

图4 乙酸铵pH 4.5的总离子流图

图5 乙酸铵pH 5.5的总离子流图

由图3可知，乙酸铵pH 3.5时，5种物质未得到较好的分离，对比图4和图5发现，乙酸铵pH 5.5时，5种物质的分离效果较好，并且吗啡、可待因、那可丁的灵敏度都有较大提高。这可能与生物碱的化学性质有关，生物碱大多是氮杂环结构，具有一定的碱性，在水中难溶，只有酸化成盐后才易溶于水，然后在碱性条件下溶于有机溶剂。因此，待测物在色谱柱上的保留程度受流动相pH的影响较大，并且会影响到离子化效率。根据水中弱碱性化合物解离平衡方程可以得出，目标物的离子化程度与pH值有关，其pH值必须小于其pKa值2个单位才可以保证目标物完全离子化，而这5种目标物的pKa范围为6.24～8.21。因此，各化合物的色谱峰在pH值为5.5时达到较好的分离效果是符合该理论的。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取方法的选择

辣条属于调味面制品，其中添加了各种调味料、防腐剂、色素、动植物油脂等，成分复杂，样品均匀性差。由于罂粟碱、可待因、蒂巴因、那可丁为碱性有机化合物，吗啡为两性有机物，它们都能与酸作用形成盐溶于水，与碱结合溶于有机试剂。所以，本实验考察了同一辣条基质空白加相同浓度标准溶液，不同的提取试剂下5种目标物的回收率情况。提取试剂分为两组，第一组分别选取20 mL 0.1 mol/L HCl溶液、乙腈-HCl(1∶1)、乙腈-水(1∶1)为提取液；第二组选取20 mL 2.5%氨化甲醇、5%氨化甲醇、10%氨化甲醇为提取液；以同一种辣条加标作为平行样，以上6种试剂作为提取液。第一组试验中样品经提取液提取后，通过固相萃取柱进行净化，有机溶剂洗脱后浓缩上样；第二组试验经氨化甲醇提取后，通过正己烷去除油脂，直接浓缩上样。进样检测后得到的各个峰面积比见表3。

表3 不同提取液条件下峰面积比对

由表3可知，第一组使用0.1 mol/L HCl溶液提取时，各目标物质均有最大的响应峰面积；第二组使用5%氨化甲醇为提取液时，各目标物质均有最大的响应峰面积；而第一组和第二组进行纵向比较，结果表明：酸性条件下5种目标物质的响应峰面积更大一些。原因可能是面制品有较强的吸水性，在水相中分散更加均匀，而且目标化合物蒂巴因、罂粟碱、可待因和那可丁呈碱性，吗啡是两性化合物，在酸性水溶液条件下很容易形成溶于水的盐类，提取效率较高。因此，本研究选用稀盐酸溶液(0.1 mol/L)作为样品的提取溶剂。

2.2.2 净化条件的优化

罂粟碱的净化方法主要有液液萃取法、QuEChERS法和固相萃取法。液液萃取法操作繁琐并且消耗大量的有机溶剂，不适合高通量检测，因此本文比较了QuEChERS法和3种不同固相萃取柱对5种生物碱的净化效果。样品经5%氨化甲醇提取后，经QuEChERS净化后直接上样测定，该方法操作简单，但基质干扰物多，净化效果不好，回收率低。另外，我们还考察了3种固相萃取柱富集净化5种生物碱的效果，基于生物碱在酸性提取液中呈阳离子状态，样品经稀盐酸提取后，分别过MCX、WCX、HLB柱，分析结果见图6。

图6 不同固相萃取柱对5种生物碱回收率的影响

由图6可知，提取液经MCX柱吸附、洗脱后取得较好的回收率。因此，我们选用MCX固相柱作为SPE净化柱。

2.3 基质效应的消除

一般采用超高效液相色谱-串联质谱进行分析检测时会有较强的基质效应，日常检测可以通过添加同位素内标以及配制基质标准溶液来减小基质效应对结果的准确性带来的影响。由于同位素内标价格昂贵，不适用高通量检测，因此我们采用配制基质标准溶液来减小基质效应。我们比较了标准溶液和基质标准溶液的信号响应差别，结果表明：基质标准溶液中5种生物碱的信号都有一定程度的抑制，因此配制基质标准工作曲线来进行定量计算是十分必要的。

2.4 标准工作曲线及检出限

我们以空白基质提取液来配制工作曲线，其中吗啡和可待因浓度为5，25，50，100，250，500 μg/L，蒂巴因、罂粟碱、那可丁浓度为1，5，10，20，50，100 μg/L。以对照品的浓度(μg/L)为横坐标，化合物的峰面积为纵坐标，计算得到表4中各个生物碱的线性回归方程，用于计算实际样品中待测物的浓度。我们以信噪比(RSN)等于3的原则分别得到5种化合物的检出限，由信噪比(RSN)等于10的原则分别得到5种化合物的定量限，结果见表4。

表4 5种生物碱的线性范围、相关系数、方法检出限和方法定量限

2.5 回收率及精密度

向2 g均质空白辣条样品中添加高、中、低5种生物碱的混合标准溶液进行加标回收实验，其中吗啡、可待因的添加浓度为2.5，12.5，50 μg/kg，蒂巴因、罂粟碱、那可丁的添加浓度为0.5，2.5，10 μg/kg，每个浓度设6个平行样。回收率及标准偏差结果见表5。

表5 5种生物碱的回收率与精密度测试结果(n=6)

2.6 实际样品分析

采用试验方法对市售的30份调味面制品(即辣条)进行测定。结果表明：30批次辣条样品中未检出5种罂粟碱成分，这说明目前辣条的生产厂商并无恶意添加罂粟碱的行为。但是随着近几年辣条成功走出国门，成为五毛零食界的奇迹，我们的监管部门更需要加大力度对其进行强有力的监管，使得这个奇迹继续延续下去，保持辣条产业的健康发展。

3 结论

本研究建立了调味面制品(俗称“辣条”)中5种罂粟碱(吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁)的超高效液相色谱-串联质谱的分析检测法。采用酸溶液超声提取，固相萃取小柱富集净化，基质匹配外标法定量。该方法检出限在0.05～0.5 μg/kg之间，平均回收率为70.2%～103.2%，相对标准偏差为1.7%～8.5%。方法简便快速，精确度、准确度和灵敏度均较高，可满足辣条中5种生物碱成分同时测定的要求，为辣条等调味面制品的安全监管提供强有力的技术支持。