响应面法优化超声辅助提取龙眼叶总黄酮的工艺研究

郑威，于雪飞，王亚立，李春研，李家磊

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学图书馆，哈尔滨 150028；3.黑龙江省农业科学院食品加工研究所，哈尔滨 150086)

龙眼叶为无患子科龙眼属常绿乔木龙眼(DimocarpuslonganLour.)的嫩芽或叶子，为我国广西地区传统的药食同源植物，人们常以茶的形式饮用[1]。我国传统医学认为，龙眼叶性味甘平，具有清热解表、祛湿排毒等作用[2]。现代西方医学认为，龙眼叶具有降血糖、抗氧化、抗病毒以及抗肿瘤等功效[3-6]。龙眼叶表现出的诸多药理活性得益于其含有丰富的活性成分，研究表明，龙眼叶主要含有黄酮类、甾醇类和萜类等活性物质，其中尤以黄酮类化合物较为丰富[7]。黄酮类物质作为植物的次生代谢产物，具有很高的药用价值，对预防癌症、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、降血脂、治疗冠心病、高血压、支气管哮喘以及心绞痛等有显著效果[8，9]。

目前，人们对龙眼叶的开发利用尚不充分，这就造成了资源的浪费。由于龙眼叶含有丰富的黄酮类物质，因此其可作为提取黄酮类化合物的原料来源。提取黄酮类化合物的方法有很多，主要有溶剂浸提法、匀浆提取法、酶辅助提取法、微波辅助提取法以及超声辅助提取法[10-14]。由于超声辅助提取法具有溶剂用量少、提取时间短以及提取率高等特点，因此越来越多的提取工艺采用超声辅助提取法[15]。鉴于此，本文以龙眼叶为原料，以乙醇溶液为溶剂，在单因素的基础上，运用响应面法对超声辅助提取龙眼叶总黄酮的工艺进行优化，旨在探索出一种高效的龙眼叶总黄酮的提取工艺，进而为后期综合利用龙眼叶提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

龙眼叶：福建省梅州龙眼叶种植基地；芦丁标准品(纯度≥98%)：成都思特曼生物有限公司；无水乙醇：北京化工有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝：天津市北方天医化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

KQ-400KDE型高功率超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；CARY100型紫外分光光度计 美国Varian公司；XS204型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；DK-98-II A型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；RE-2000A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-III型循环水式真空泵 巩义市英峪高科仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 龙眼叶总黄酮的提取

将新鲜龙眼叶50 ℃烘干，粉碎过60目筛，然后称取1 g龙眼叶粉置于烧杯中，在一定的提取温度、液料比、乙醇浓度和提取时间的条件下进行总黄酮的超声提取，然后将得到的提取液抽滤、定容待测。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

精确称取芦丁标准品18.9 mg，用95%的乙醇溶解后定容至100 mL的容量瓶中待用；称取芦丁标准液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL后置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 1%氯化铝溶液，用95%的乙醇溶液定容、摇匀，静置20 min；在410 nm波长处测定吸光值；吸光值测定重复3次，并取平均值，绘制标准曲线；标准曲线的回归方程为Y=13.566X-0.0258，R2=0.9966。

1.3.3 龙眼叶总黄酮得率的计算

将龙眼叶提取液按1.3.2操作，测得吸光度，由芦丁标准曲线测得总黄酮质量，龙眼叶总黄酮得率按下式计算。

1.3.4 单因素试验设计

考察单因素乙醇浓度(10%，30%，50%，70%，90%)，液料比(10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1)，超声时间(60，90，120，150，180 min)和超声温度(40，50，60，70，80 ℃)对龙眼叶总黄酮得率的影响。

1.3.5 响应面试验设计

在单因素试验基础上，以超声时间、超声温度、液料比和乙醇浓度为考察因素，以龙眼叶总黄酮得率为响应值，选用响应面Box-Benhnken 试验设计对超声辅助提取龙眼叶总黄酮的工艺参数进行优化。

1.3.6 数据处理

所有试验都进行 3 次重复，所得数据以平均值±标准差(SD)表示，采用 Origin 8.5 软件作图；响应面Box-Benhnken 试验采用 Design-Expert V8.0.6.1 软件进行设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素对龙眼叶总黄酮得率的影响

2.1.1 乙醇浓度对龙眼叶总黄酮得率的影响

选择超声时间为120 min，超声温度为60 ℃，液料比为30∶1，分别用10%，30%，50%，70%，90%的乙醇溶液进行龙眼叶总黄酮的提取，得率见图1。

图1 乙醇浓度对龙眼叶总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from longan leaves

总黄酮的得率随乙醇浓度的增大先升高后降低。当乙醇的体积浓度达到70%时，总黄酮的得率最大，随着乙醇浓度的继续升高，总黄酮的得率呈现下降的趋势。产生的原因可能是当乙醇浓度过大时，易溶于乙醇溶液的杂质与龙眼叶总黄酮竞争结合乙醇-水分子加剧，加之整个溶液体系粘度增大，导致龙眼叶总黄酮溶出困难，因此，70%的乙醇分数适用于龙眼叶总黄酮的提取溶剂。

2.1.2 液料比对龙眼叶总黄酮得率的影响

选择超声时间为120 min，超声温度为60 ℃，乙醇浓度为50%，分别用10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1的液料比提取龙眼叶总黄酮，得率见图2。

图2 液料比对龙眼叶总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of total flavonoids from longan leaves

随着液料比的增加，总黄酮的得率呈先增加后下降的趋势，当液料比为40∶1时，总黄酮的得率达到最大值。当液料比继续增加，总黄酮的得率随之降低，这可能与溶剂的使用量相关，溶剂量增大，样品的分散程度好，接触面积变大，利于黄酮物质的溶出，增加得率；溶剂的使用量过大时，一些可能与黄酮结合的杂质溶出，导致总黄酮得率的降低。因此，本试验的最佳提取液料比为40∶1。

2.1.3 超声时间对龙眼叶总黄酮得率的影响

选择乙醇浓度为50%，液料比为30∶1，超声温度为60 ℃，分别用60，90，120，150，180 min提取龙眼叶总黄酮，得率见图3。

图3 超声时间对龙眼叶总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids from longan leaves

当超声时间为120 min时，龙眼叶总黄酮的得率达到最大值，随着时间的延长，总黄酮的得率逐渐降低，这可能是由于龙眼叶总黄酮在120 min内已经全部提取完成，若提取时间过长，黄酮易被氧化和降解，导致得率的降低。因此，本试验的最佳提取时间为120 min。

2.1.4 超声温度对龙眼叶总黄酮得率的影响

选择乙醇浓度为50%，液料比为30∶1，超声时间为120 min，分别用40，50，60，70，80 ℃提取龙眼叶总黄酮，得率见图4。

图4 超声温度对龙眼叶总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total flavonoids from longan leaves

龙眼叶总黄酮的得率随温度的增加先升高后降低，当温度达到60 ℃时，总黄酮的得率达到最大值。随着温度继续升高，总黄酮的得率逐渐降低，这可能是由于适当地升高温度可有效地降低溶液体系的粘度，有利于黄酮类物质的扩散和溶解度的增加，然而温度过高导致黄酮氧化和降解，从而使得龙眼叶总黄酮的得率下降。因此，本试验的最佳提取温度为60 ℃。

2.2 响应面法确定龙眼叶总黄酮得率的最佳工艺参数

2.2.1 响应模型的建立与分析

本文在单因素试验的基础上进行响应面试验的设计，采用Box-Behnken试验设计，用自变量A，B，C，D分别代表乙醇浓度、液料比、超声温度、超声时间4个影响因素，以龙眼叶总黄酮得率为响应值Y。本文设计的试验因素水平及编码值见表1，响应面分析方案与结果见表2。

表1 响应面因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface

表2 响应面分析方案与结果Table 2 Analysis and results of response surface

续 表

利用Design-Expert V8.0.6.1软件对试验结果进行二次多项式回归模型方程拟合，获得的回归模型方程如下：

Y=162.23+15.49A+8.09B+8.95C+22.24D-4.18AB-4.59AC-4.79AD-0.76BC-3.52BD-4.89CD-5.56A2-1.63B2-8.13C2-18.02D2。

式中：Y为总黄酮得率，mg/g；A为乙醇浓度，%；B为液料比；C为超声温度，℃；D为超声时间，min。

回归方程的方差分析结果见表3，模型的P值<0.0001，差异极显著；失拟项P=0.2968>0.05，差异不显著；模型确定系数 R2=0.9599；模型调整确定系数Radj2=0.9198；方差分析结果表明模型的拟合度良好，试验的误差小，所建模型能够很好地反映响应值的变化。

表3 回归模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

续 表

注：“*”表示显著差异，P<0.05；“**”表示极显著差异，P<0.01；R2=0.9599；Radj2=0.9198。

P值可检查各个因素的显著性，由P值结果可知，因素 A，B，C，D，C2和D2极显著，A2显著，其他因素不显著，影响程度主次顺序为D>A>D2>C>B>A2。

响应面图是响应值对各试验因素所构成的三维空间曲面图，可直观反映各试验因素的交互作用及对响应值的相对显著性。任意2个试验因素交互作用的响应面图见图5。

图5 任意2个因素交互作用对龙眼叶总黄酮得率影响的响应面图

由图5可知，任意2个试验因素之间均存在明显的交互作用，并且最佳落点在试验考察的区域内。

2.2.2 最佳提取条件的确定及验证

通过对工艺参数的优化，本文建立了以龙眼叶总黄酮提取率为目标值的试验体系。最佳工艺条件为：乙醇提取浓度90%，液料比48∶1，提取温度61 ℃，提取时间132 min。在最优的条件下对建立的数学模型进行验证试验，结果见表4。获得的龙眼叶总黄酮的实际测得值为181.83 mg/g，预测值为177.32 mg/g，预测误差为2.54%，小于5%，因此，证实了预测值的准确可靠。

表4 最优条件的预测值和实测值(n=3)Table 4 The predicted value and measured value of the optimal conditions(n=3)

3 结论

本文以龙眼叶为原料，以乙醇溶液为溶剂，在单因素的基础上，运用响应面法对超声辅助提取龙眼叶总黄酮的工艺进行优化，确定最佳工艺条件为：乙醇浓度90%，液料比48∶1，提取温度61 ℃，提取时间132 min。龙眼叶总黄酮得率的预测值为177.32 mg/g，实际值为181.83 mg/g，与优化方案的理论值相接近，表明建立的模型可靠。因此，本文所采用的响应面法优化超声辅助提取龙眼叶总黄酮的工艺稳定可靠，该工艺可为龙眼叶的综合利用及龙眼叶总黄酮的产业化应用提供一定的理论支撑。