miR-182在子宫内膜癌中表达及其对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

2018-08-10姚红梅孔凡荣周烨

东南大学学报（医学版） 2018年4期

姚红梅，孔凡荣，周烨

(济宁医学院附属医院妇产科，山东济宁 272100)

1 材料与方法

1.1 标本

选取2015年10月至2017年4月在济宁医学院附属医院进行手术治疗的42例子宫内膜癌标本，患者年龄30～65岁，平均(52.04±7.24)岁；其中Ⅰ型30例，Ⅱ型12例。所有患者手术前均未进行放疗或化疗等，术中收集子宫内膜癌组织；另外选取同期因子宫脱垂或子宫颈癌等原因进行子宫切除术且病理检查显示子宫内膜正常的标本15例，患者年龄28～65岁，平均(51.39±8.37)岁，术中收集正常子宫内膜组织。本研究经由济宁医学院附属医院伦理委员会许可，且所有患者对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 细胞和试剂

GUAGAACUCACACUGGUGAGGUAACAGGAUCCGGUG

GUUCUAGACUUGCCAACUAUGGGGCGAGGACUCAGC

1.3 细胞培养

1.4 rea time PCR检测mi 182或Foxo1表达

采用TRIzol试剂提取子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织的总RNA，经紫外分光光度计测量总RNA含量，并取1g·ml-1总RNA，进行逆转录反应合成cDNA。再以cDNA作为模板，使用mi182和对照U6引物配制PCR反应体系：2×qPCR Mix 12.5 μl；2.5 μmol·L-1引物2.0 μl；cDNA 2.0 μl；ddH2O 8.5 μl；轻轻混匀后离心，放入荧光定量PCR仪(applied Biosystems 7500)中。设置反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循环40次；72 ℃末段延伸5 min，最后运行溶解曲线程序，72 ℃→95 ℃，每20 s升温1 ℃。内参U6引物：F为5CTCGCTTCGGCAGCAC3′，R为5AACGCTTCACGAATTTGCG3′；mi182引物：F为5ACACTCCAGCTGGGTTTGGCAATGGTAGAAC3′，R为5TGGTGTCGTGGAGTC3′。以相似的实验方法检测RL92细胞中Foxo1的表达，以GAPDH作为对照，其中Foxo1引物：F为5TGGACATGCTCAGCAG

1.5 细胞转染

1.6 MTT检测细胞增殖活性

1.7 Western blot检测蛋白表达

抑制剂作用48 h后，收集细胞沉淀，加入适量细胞裂解液冰上裂解细胞，提取总蛋白。采用BCA法进行蛋白定量后，取20g总蛋白进行SDPAGE电泳，并转膜至PVDF膜上。经5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h后使用PBST洗膜，然后分别使用Cyclin D1、Foxo1、activecaspase3和GAPDH一抗稀释液(1∶1 000)进行孵育，4 ℃过夜。PBST洗膜后再使用二抗稀释液(1∶10 000)室温孵育1 h，经PBST洗膜后使用ECL显色液显色，全自动化学发光分析仪(Tanon)成像。