小鼠下颌第一磨牙胚胎发育过程中的Notch信号表达

居燕云，刘婷，苗雷英，汤旭娜

(南京大学医学院 附属口腔医院/南京市口腔医院，江苏 南京 210008)

牙齿发育启动来源于口腔上皮分泌的诱导信号，发育早期的上皮诱导信号旁分泌到下方的牙源性间充质，激活间充质中特定的转录因子(Msx、Dlx、Pax)，特异性地调控牙齿发育的启动过程，从而引导牙齿形态发生[1]。小鼠的胚胎发育仅为20 d左右,在胚胎龄(embryonic day，ED)第11.5天牙齿发育开始启动，首先在上皮发生形态变化，表现为局部的口腔上皮增厚形成牙板并向深层的外胚间充质内陷。胚胎发育第13.5天时，牙板上皮增生形成圆形或卵圆形的上皮芽，此上皮阶段称为蕾状期成釉器，此时成釉器内上皮细胞未见分化，其周围的外胚间充质细胞出现聚集，包绕在上皮芽周围。胚胎发育至14.5 d时，成釉器呈现帽状，成釉器内的细胞开始出现分层，形成内釉上皮层、外釉上皮层和星网状层，而成釉器下方密集的外胚间充质细胞仍未出现分化[2]。当牙胚进入16～19 d时，成釉器形成钟状结构，被包绕的牙源性间充质细胞增多，并出现细胞的分化，开始形成成牙本质细胞。小鼠牙胚发育早期，ED 14.5 d时，Notch蛋白在牙胚组织中特异性表达，但由于Notch通路上众多分子参与，且与其他发育相关信号通路多有交叉。本研究拟对牙胚发育早期，探寻与决定牙胚细胞命运相关的Notch信号通路情况。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 牙胚组织的分离 C57BL/6小鼠妊娠第14.5天和第18.5天，将吸入麻醉后的孕鼠颈椎脱臼法处死,剖开子宫取出胎鼠,体视显微镜(Nikon SMZ1500，Japan)下，分离下颌第一磨牙牙胚组织，分离后投入冻存管，4%多聚甲醛固定24 h后-80 ℃冰箱保存，石蜡定向包埋，行冠状截面10 μm冰冻组织切片。

1.2.2 实验分组 一组：ED 14.5 d C57BL/6小鼠下颌第一磨牙牙胚组织。二组：ED 18.5 d C57BL/6小鼠下颌第一磨牙牙胚组织。

1.2.3 免疫组织化学染色 切片PBS(pH 7.2)洗5 min ×2次，10%马血清37 ℃封闭30 min，PBS洗5 min ×3次，一抗孵育4 ℃过夜(浓度为1∶100)，PBS洗5 min×3次，二抗(生物素标记驴抗兔多克隆IgG，浓度为1∶100)室温孵育30 min。PBS洗5 min×3次， 三抗(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素,工作液)室温孵育15 min，PBS洗5 min×4次。DAB显微镜下显色至满意，苏木素复染细胞核，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜观察、照相。

2 结 果

2.1 Notch蛋白在ED 14.5 d小鼠牙胚中表达

ED 14.5 d，牙齿发育帽状期，小鼠下颌第一磨牙牙胚成釉器内有Notch1的高表达，而成釉器周围聚集的间充质则未见明显表达；Notch3在小鼠下颌第一磨牙牙胚成釉器及成釉器周围聚集的间充质细胞中均有较高的表达(图1)。

2.2 ED 18.5 d牙胚形态

分离小鼠ED 18.5 d下颌第一磨牙牙胚，根据前期研究不同发育期小鼠下颌第一磨牙组织HE染色及免疫组织化学结果为基础，在牙胚位置去除表面口腔上皮，取出牙胚组织，此时牙胚与周围组织连接疏松，可以完整去除，牙冠已有牙尖形态成形(图2)。

3 讨 论

本研究发现，Notch1在小鼠下颌第一磨牙成釉器高表达，而成釉器周围聚集的间充质则未见明显表达；Notch3在小鼠下颌第一磨牙牙胚成釉器和成釉器周围聚集的间充质细胞中均有高表达。Notch信号通路是一条高度保守的细胞间转导机制系统，广泛参与各种组织细胞的分化、增殖及凋亡过程，具有重要作用[5]。之前的研究发现Notch可能是维持小鼠颌下腺中干细胞数量的重要信号分子之一[6]，也证实了Notch信号通路在增强牙髓干细胞增殖和调节分化中的潜在参与，并且在体外和体内损伤后的牙髓细胞中均活化和动态表达Notch信号[7]。Notch可能在维持牙髓干细胞的增殖和分化之间的正确平衡方面发挥重要作用，就像它们对造血干细胞那样[8]。发育起始期及蕾状期牙胚周围是一个正在发育的牙囊[9]，对细胞谱系的研究表明，牙囊中的一些细胞也具有分化成牙乳头细胞甚至牙髓细胞的能力,例如成牙本质细胞[10]。处于某一发展阶段的干细胞或前体细胞可能进一步发育成其他细胞，也可能维持到成体时期[9]。牙髓干细胞存在自我更新和维持的控制机制，并且对使用牙髓干细胞进行细胞治疗具有重要的潜在影响[11]。

A、B、C. Notch1在下颌第一磨牙成釉器高表达，放大倍数分别为100、200、400；D、E、F.Notch3在下颌第一磨牙成釉器及周围聚集的间充质细胞中高表达，放大倍数分别为100、200、400；G、H.ED 14.5 d小鼠下颌第一磨牙成釉器已进入帽状期，其周围有明显的间充质细胞聚集，今后将发育为牙乳头，放大倍数分别为100、200。*.下颌发育中心；E′.成釉器；M′.间充质

图1ED14.5d小鼠下颌第一磨牙牙胚Notch1、Notch3免疫组化结果和下颌H&E染色结果

A.绿色虚线即为下颌第一磨牙牙胚处，星标为舌；B.为去除舌的小鼠下颌组织；C.小鼠下颌左侧第一磨牙牙胚取出后见绿框内所示；D.为去除的下颌第一磨牙牙胚组织，可见牙尖外形(箭头所示)

图2ED18.5d小鼠下颌第一磨牙牙胚分离结果

Notch1从帽状期的牙乳头至牙釉质、牙本质分泌期的牙髓中尽管表达较少，但它们中的一些是条索状的，类似于神经和血管细胞，也有一些是小圆形细胞，符合干细胞的形态特征。因此，Notch1也可能是牙髓干细胞的标志物之一。Notch3不仅在发育的成釉器周细胞中表达，并且在具有发育潜力的间充质细胞中也表达。Notch1、Notch3可能参与牙胚上皮细胞的分化，尤其是成釉上皮细胞的分化，可能在牙囊、牙乳头和牙髓发育及发育成熟后维持干细胞中发挥作用。Notch信号在牙胚发生发育过程中有非常重要的调控作用，有必要进一步探讨激活Notch信号通路引导细胞增殖分化。