肝窦内皮细胞对肝细胞生物学特性影响的体外研究

符思远，罗杏英，门秀丽，张文健，娄晋宁，许诚，李宓

(1.东莞东华医院 肾内科，广东 东莞 523000； 2.中山大学附属第五医院 血液净化中心，广东 珠海 519000； 3.华北理工大学基础学院 病理生理系，河北 唐山 063009；4.中日友好医院 临床医学研究所，北京 100029； 5.苏州瑞徕生物科技有限公司，江苏 苏州 215000； 6.深圳市第三人民医院 肝病医学部，广东 深圳 518000)

肝衰竭在全球致死性疾病中排位第七，行内科保守治疗其病死率也达50%～80%[1]。肝移植是治疗肝衰竭最有效方法[2]，供体短缺、错失移植时机、免疫排斥反应等问题使大部分患者不能得到及时治疗[3]。采用生物型人工肝(bioartificial liver, BAL)是近年发展起来的有效治疗手段，其依靠生物反应器中的肝细胞提供分泌、代谢、生物转化和解毒等功能[4]，更大程度接近人体肝脏。肝细胞在生物反应器内的活性及功能决定了BAL的治疗作用[5]。原代人肝细胞是BAL最理想的细胞材料，但体外增殖困难、体外培养功能迅速丢失等问题限制了其临床应用，而永生化人肝细胞(IHH)通过基因转染技术使肝细胞达到永生化，克服了上述问题[4,6]。肝细胞与非实质细胞共同培养能模拟体内微环境，维持和促进肝细胞的功能，提高代谢物产量[7-8]。本研究通过IHH与永生化人肝窦内皮细胞(IHLSEC)共培养，观察IHH生长情况，评估肝细胞功能的变化，为进一步提高生物人工肝的合成、解毒、生物转化等功能提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

1.2 方 法

1.2.3 IHLSEC与IHH共培养的细胞生长情况 (1) 单 独培养组：将4×105孔-1的对数生长期IHH细胞接种于6孔板中，作为对照组；(2) 共培养组：1×105孔-1的IHLSEC和4×105孔-1的携带EGFP基因的IHH混合接种于6孔板中。分别于24、48、72 h在荧光显微镜下观察细胞生长情况。

扩增片段引物序列产物长度/bpβ-actin上游:5'-GACATCCGTAAAGACCTCTAT-GCC-3'下游:5'-ATAGAGCCACCAATCCACA-CAGAG-3'173API上游:5'-ATGCTGCCCAGAAGACAGATA-3'下游:5'-CTGAAGGCGAACTCAGCCA-3'91UGT上游:5'-TTGTCTGGCTGTTCCCACTTA-3'下游:5'-GGTCCGTCAGCATGACATCA-3'85GST上游:5'-CTGCCCGTATGTCCACCTG-3'下游:5'-AGCTCCTCGACGTAGTAGAGA-3'185GS上游:5'-TAAGGACCCTAACAAGCTGGT-3'下游:5'-CCGTTTACAGGTGTGCCTCAA-3'88ALB上游:5'-TGCAACTCTTCGTGAAAC-CTATG-3'下游:5'-ACATCAACCTCTGGTCTCACC-3'135

1.2.6 微载体大规模培养 IHH、IHLSEC：将Cytopore 2按照生产商的说明进行预处理，将细胞悬液与微载体混合。单独培养组的接种密度为8×105ml-1的IHH，共培养组接种密度为8×105ml-1的IHH和2×105ml-1的 IHLSEC混合。微载体浓度为10 mg·ml-1。细胞贴附微载体后每隔3 d更换新鲜培养基。每隔5 d，荧光显微镜下观察细胞生长情况，直至细胞生长达到微载体80%以上。

1.2.7 分析培养后IHH对肝衰竭患者血浆的解毒作用 两组微载体沉淀后去除上清，分别取10 ml加入同等体积的肝衰患者血浆，混匀后，在24孔细胞培养板中每孔加入1 ml，分别于0、24、48、72 h吸取上清(每个时间点设定5个平行样)，以1 200 r·min-1离

心5 min，吸取上清400 μl于-20 ℃储存。样本收集完毕后，检测总胆红素、尿素浓度。

1.3 统计学处理

使用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，行两组独立样本的t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 IHLSEC和IHH的形态及鉴定

图1IHLSEC细胞株鉴定(400)

Fig1IHLSECcelllineidentification(400)

2a. IHH细胞株形态；2b. API的细胞免疫荧光染色

2a. IHH cell morphology; 2b. Immunofluorescence of API

图2IHH细胞株的鉴定(200)

Fig2IHHcelllineidentification(200)

2.2 构建携带EGFP基因的IHH

成功转染EGFP基因的IHH细胞形态正常，并稳定表达绿色荧光蛋白，且没有淬灭现象。暗视野观察可见全部存活细胞均发出绿色荧光(图3)。

2.3 IHLSEC与IHH共培养的细胞增殖情况

单独培养组IHH散在分布，细胞间无明显接触；共培养组的IHH细胞间紧密接触，聚集成团，这种现象随着培养时间延长愈发明显(图4)。

2.4 Rea time PCR分析培养后IHH功能基因的表达

单独培养组和共培养组的IHH均能表达肝细胞特异基因API，并能表达参与氨代谢的酶GS、参与氧化还原反应的Ⅱ相酶GST、参与胆红素代谢的酶UGT1A1以及ALB基因的表达。另外，与单独培养组相比，共培养组 IHH的上述 mRNA表达量增高(P<0.01)(图5)。

3a. IHH转染EGFP基因前(明场)；3b. IHH转染EGFP基因前(暗场)；3c. IHH转染EGFP基因后(明场)；3d. IHH转染EGFP基因后(暗场)

3a. IHH before transfected GFP gene (bright field);3b. IHH before transfected GFP gene (darkfield); 3c. IHH after transfected GFP gene (bright field);3d. IHH after transfected GFP gene (darkfield)

图3荧光显微镜下观察IHH的荧光情况(200)

Fig3FluorescenceofIHHobservedunderfluorescentmicroscope(200)

4a. 单独培养24 h; 4b. 共培养24 h;4c. 单独培养48 h; 4d. 共培养48 h; 4e. 单独培养72 h; 4f. 共培养72 h

图4荧光显微镜下观察IHH的增殖情况(200)

Fig4ThegrowthofIHHobseredbyafluorescencemicroscope(200)

图5培养72h后IHHGS、GST、UGT1A1、ALBmRNA表达情况

2.5 Western blotting分析培养后IHH功能蛋白表达

两组IHH的GS、GST、UGT1A1、ALB蛋白表达均为阳性；与单独培养组相比，共培养组 IHH的上述蛋白表达量增高(P<0.01)(图6)。

2.6 培养后IHH对肝衰竭患者血浆的解毒作用

两组细胞接种于微载体后与肝衰竭患者的血浆共孵育3 d后，共培养组血浆总胆红素下降更显著(P<0.01)(图7)，血浆尿素水平上升更显著(P<0.01)(图8)。

3 讨 论

图6培养72h后IHHGS、GST、UGT1A1、ALB蛋白表达情况

图7与肝功能衰竭患者血浆共孵育IHH对总胆红素的影响

Fig7Plasmatotalbilirubindetectedafterthetwogroupsculturedonmicrocarriersincubatedwithplasmaofpatientswithliverfailure

图8与肝功能衰竭患者血浆共孵育IHH对尿素的影响

Fig8Ureadetectedafterthetwogroupsculturedonmicrocarriersincubatedwithplasmaofpatientswithliverfailure

本实验结果显示，IHLSEC与IHH共培养能够上调IHH特异功能基因和蛋白的表达，增强IHH的代谢、解毒、合成功能。显微镜下显示，IHLSEC与IHH无明显细胞间接触，推测IHLSEC可能通过提高细胞间的信号和物质传递增强IHH的基因表达和细胞功能。

目前已有肝细胞与肝星状细胞[17]、库否细胞[18]、内皮细胞[19]、间充质干细胞[20]等共培养的相关研究，虽然均不同程度地促进肝细胞功能，但上述共培养体系存在着不能更好地模拟人体肝脏的结构、细胞来源异种性、细胞表型不能持久保持等问题，临床实际应用受到限制。

生物人工肝所需要肝细胞数量应达到肝脏质量的10%～15%，即(1～2)×1010个肝细胞，如此大规模体外细胞培养按照传统的培养方式很难实现。大孔微载体表面积与体积比值大，不易发生细胞接触抑制，能够实现IHH高密度增殖；IHH在微载体孔道内生长，紧密接触，能够模拟体内生长微环境；培养基能通过纤维素构成的微载体，使IHH充分吸收营养物质。本实验中采用的Cytopore 2为直径200～280 μm的大孔微载体，肝细胞直径约20 μm，而孔道直径约30 μm。 IHH能够进入微载体进行大量增殖，使得体外培养大规模高活性IHH成为现实。

与单独培养组相比，共培养组共孵育的血浆总胆红素下降以及尿素上升均更显著，证实了IHLSEC与IHH共培养后增强了IHH清除血浆胆红素和血氨的能力。

总之，IHLSEC与IHH共培养能够促进IHH细胞间的紧密连接，上调IHH特异功能基因、蛋白的表达，增强其代谢、解毒、合成功能；体外解毒实验进一步验证了IHLSEC与IHH在微载体Cytopore 2上共培养能够增强IHH清除血浆胆红素和血氨的能力，并增强其对毒性物质的抵抗能力。IHLSEC通过哪种信号通路、什么细胞因子促进肝细胞功能以及IHLSEC与IHH以多少细胞数量比例进行共培养还有待进一步研究。