白藜芦醇丹阳黄酒抗氧化活性和稳定性研究

乔晓月，靳迎春，曹喜涛，2*，徐志坚，屠 洁，2，刘冠卉，4，张兆俊，季更生，2，张国政，2

（1.江苏科技大学 生物技术学院，江苏 镇江 212018；2.中国农业科学院 蚕业研究所 农业部蚕桑遗传改良重点开放实验室，江苏 镇江 212018；3.江苏省丹阳市金丹阳酒业有限公司，江苏 镇江 212300；4.江苏科技大学粮食学院，江苏 镇江 212004）

黄酒是我国特有的具有中华民族特色的最为古老的酒类之一，被誉为“国酒”，它与葡萄酒、啤酒并称为世界三大古酒。在我国，黄酒是一种集烹饪、营养、饮用和保健作用的传统民族酒[1]。江苏丹阳黄酒酿造历史源远流长，凭文献记录的已有1 700年，俗名陈酒，早在1971年被江苏省评酒会评为江苏省“七大名酒”之一。丹阳黄酒独树一帜，其酒色泽黄橙透明，鲜甜香美，醇和爽口，灌坛封缸贮窖越经久，风味越佳，是比较理想的酒精饮料[2]。

白藜芦醇（resveratrol，Res），化学名为3,5,4'-三羟基芪（3,5,4'-trihydroxystilbene），作为含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，白藜芦醇是植物在逆境刺激非胁迫条件下产生的植物次生代谢产物，具有较强的抗菌作用，是植物保护素或植物抗毒素[3]。此外，白藜芦醇可以清除自由基，抑制由活性氧引起的脂质过氧化和脂蛋白修饰，从而起到抗氧化、保护心血管的作用[5-6]。总之，白藜芦醇具有抗菌、抗氧化、抗癌、延缓衰老、心血管保护等诸多生理作用，在药品、保健食品、化妆品方面有着良好的应用前景[3]。目前，国内仅有余国军等[4]发明了一种在半甜型湖北房县黄酒中添加白藜芦醇的方法，但未见该专利研究含白藜芦醇房县黄酒的稳定性。而在丹阳黄酒——甜型黄酒为代表的白藜芦醇黄酒研究未见报道。

本研究通过向丹阳黄酒中添加白藜芦醇，探讨了添加白藜芦醇的丹阳黄酒体外抗氧化活性和稳定性，旨在为深入开发具有更好保健作用的新型丹阳黄酒做前期研究，但白藜芦醇在黄酒中的稳定性还需要进一步的研究来提高。添加白藜芦醇丹阳黄酒的开发可以迎合消费者新颖、健康的消费理念，为古老的丹阳黄酒注入现代科技元素，提高产品知名度和消费量，为黄酒行业的创新发展贡献力量[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄酒（江苏丹阳市金丹阳酒业有限公司五年陈酿老陈酒）：购自镇江当地超市；

反式白藜芦醇标准品（纯度≥99.8%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、二苯代苦味酰基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、无水乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、30%过氧化氢、三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾、2,2-联氨-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate，ABTS）、过硫酸钾（均为分析纯）：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Spectra Max i3酶标仪：美国Molecular Devices公司；1260型高效液相色谱（high performance liquid chromatog raphy，HPLC）仪：安捷伦科技有限公司；RE-52B旋转蒸发仪：南京科尔仪器有限公司；循环水式多用真空泵SHZ-D（Ⅲ）：常州英峪予华仪器有限公司

1.3 方法

1.3.1 白藜芦醇丹阳黄酒的制备方法

准确称量25.000 mg的白藜芦醇样品，用无水乙醇溶解且定容在25 mL的容量瓶，获得1.00 mg/mL的样品原液，并用丹阳黄酒稀释，获得质量浓度为0.10 mg/mL的白藜芦醇丹阳黄酒。分别取0.10 mg/mL的添加白藜芦醇的丹阳黄酒0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL，再用蒸馏水补足至1 mL作为稀释液，同样的方法稀释普通黄酒、0.10 mg/mL的维生素C（vitamin C，VC）溶液和1.00mg/mL的维生素C溶液。0.10 mg/mL维生素C溶液编号A，1.00 mg/mL的维生素C溶液编号B，白藜芦醇丹阳黄酒编号C，普通丹阳黄酒编号D。

1.3.2 DPPH自由基清除能力测定[8-10]

取2 mL样品分别加入2 mL 0.4 mmoL/L的DPPH无水乙醇溶液，使其混合均匀，室温下避光静置30 min，在波长517 nm处测定其吸光度值为Ai。同样，将添加白藜芦醇的黄酒样品换成等体积的无水乙醇，在波长517 nm处测定其吸光度值为Ao。再将DPPH溶液换成等体积的无水乙醇，在波长517 nm处测定其吸光度值为Aj，所有样品重复测定3次，以0.10 mg/mL维生素C溶液作为阳性对照，计算半抑制浓度（half maximal inhibitoryconcentration，IC50）值。DPPH自由基清除率计算公式如下：

1.3.3 羟自由基清除能力测定[10-11]

采用水杨酸法测定样品羟自由基清除能力。分别配制 8.8 mmol/L H2O2、9.0 mmol/L硫酸亚铁溶液、9.0 mmol/L水杨酸（无水乙醇配），体积都为1 mL。取样品1 mL，分别加1 mL硫酸亚铁溶液、1 mL水杨酸溶液、1 mL样品，最后加过氧化氢启动反应，37℃条件下反应15 min后，在波长510 nm处测定吸光度值Ax；将样品换成去离子水测定吸光度值Ao；最后以硫酸亚铁、水杨酸、样品和去离子水混合液测定吸光度值Axo，所有样品重复测定3次，以1.00 mg/mL维生素C溶液作为阳性对照。计算IC50值。羟自由基清除率计算公式如下：

1.3.4 ABTS自由基清除能力测定[12-14]

取去离子水配制7mmol/LABTS溶液，同样配制2.6mmol/L的过硫酸钾水溶液取88 μL和ABTS预备液5 mL混合均匀于室温下避光放置16 h形成ABTS工作液，将ABTS工作液用无水乙醇适当稀释，使其在波长734 nm处的吸光度值在0.7左右。将0.2 mL样品与1.9 mL的ABTS溶液混合均匀，静置3min后测定其吸光度值As。以蒸馏水代替样品测定吸光值Ao，所有样品重复3次。以0.10 mg/mL维生素C溶液作为阳性对照，计算IC50值。ABTS自由基清除率计算公式如下：

1.3.5 总抗氧化能力测定[10，15-17]

取1 mL样品，加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）1 mL、质量分数为1%的铁氰化钾1 mL混合均匀，在50℃条件下水浴20 min，取出后快速冷却加入10%三氯乙酸1 mL，离心（4 000 r/min、5 min）取上清液2mL，加入2mL的蒸馏水及0.4mL质量分数为0.1%三氯化铁混合均匀，放置10 min，在波长700 nm处测定吸光度值A。所有样品重复测定3次。以0.10 mg/mL维生素C溶液作为阳性对照。吸光度值越大，说明样品还原力越强。

1.3.6 添加白藜芦醇的新型丹阳黄酒稳定性研究

取1mg/mL的白藜芦醇样品原液，用丹阳黄酒分别稀释成质量浓度为10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的添加白藜芦醇的丹阳黄酒。室内未避光常温（22～27℃）密封放置60 d，分别于0、3 d、6 d、12 d、24 d、36 d、48 d、60 d测定新型丹阳黄酒中的白藜芦醇含量，研究其在常温下的稳定性。

1.3.7 黄酒中白藜芦醇含量的测定

采用高效液相色谱法（HPLC）测定新型丹阳黄酒中的白藜芦醇含量[18]。

样品预处理：取10 mL葡萄酒，加10 mL乙酸乙酯，摇动萃取15 min，静置分层后分液，再加入10 mL乙酸乙酯重复一次，将两次有机相合并后40℃旋转蒸发至干，残留物用甲醇溶解定容至5 mL。高效液相色谱仪分析测定前经0.45 μm滤膜过滤。操作过程中注意避光。

HPLC色谱条件：色谱柱C18柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相为乙腈和0.1%醋酸水（35∶65，V/V），流速1.5 mL/min，柱温30℃，检测波长306 nm，进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 对DPPH自由基清除率

将0.10 mg/mL白藜芦醇丹阳黄酒、0.10 mg/mL维生素C溶液和不含白藜芦醇的普通丹阳黄酒分别进行梯度稀释，比较3种样品对DPPH自由基的清除能力，结果见图1。由图1可知，在0～0.8 mL/mL范围内DPPH自由基清除率与不同黄酒和维生素C溶液之间呈良好的线性关系；超过0.8 mL/mL之后清除率趋向平稳，添加白藜芦醇后的丹阳黄酒对DPPH自由基清除能力在不同浓度时的清除率均明显高于普通丹阳黄酒清除率，两值相差15%以上，说明新型丹阳黄酒对DPPH的清除能力大于普通黄酒。

图1 不同的丹阳黄酒及VC对DPPH自由基清除能力Fig.1 Scavenging capacities of different DanyangHuangjiuand VC on DPPH free radical

表1 三种样品的DPPH自由基清除率IC50值Table 1 IC50values of three samples on scavenging DPPH free radical

3种样品DPPH自由基清除IC50值见表1。由表1可知，IC50值从小到大排列为维生素C（0.35 mL/mL）＜白藜芦醇丹阳黄酒（0.40 mL/mL）＜普通丹阳黄酒（0.70 mL/mL），说明对于DPPH自由基清除能力，维生素C溶液＞白藜芦醇丹阳黄酒＞普通丹阳黄酒，表明白藜芦醇清除能力明显强于普通丹阳黄酒。

2.2 对羟自由基清除率

将0.10 mg/mL白藜芦醇丹阳黄酒、1.00 mg/mL维生素C溶液和不含白藜芦醇的丹阳黄酒分别进行梯度稀释，比较3种样品对羟自由基的清除能力，结果见图2。由图2可知，在0～1.00 mL/mL范围内羟自由基清除率呈良好的线性关系；添加白藜芦醇后的丹阳黄酒羟自由基清除率在不同浓度时比普通丹阳黄酒略高，两者清除率差值不超过10%，说明新型丹阳黄酒的羟自由基清除能力略高于普通丹阳黄酒。

图2 不同的丹阳黄酒及VC对羟自由基清除能力Fig.2 Scavenging capacities of different DanyangHuangjiuand VC on hydroxyl free radical

3种样品羟自由基清除IC50值见表2。由表2可知，IC50值从小到大排列为维生素C（0.50 mL/mL）＜白藜芦醇丹阳黄酒（0.80 mL/mL）＜普通丹阳黄酒（0.81 mL/mL），说明对于羟自由基，维生素C溶液清除能力比白藜芦醇丹阳黄酒强，白藜芦醇丹阳黄酒清除能力比普通丹阳黄酒略强。

表2 三种样品的羟自由基清除率IC50值Table 2 IC50values of three samples for scavenging·OH

2.3 对ABTS自由基清除率

将0.10 mg/mL白藜芦醇丹阳黄酒、0.10 mg/mL维生素C溶液和不含白藜芦醇的丹阳黄酒分别进行梯度稀释，比较3种样品对ABTS自由基的清除能力，结果见图3。由图3可知，在0～1.00 mL/mL范围内ABTS自由基清除率与不同黄酒和维生素C溶液溶液之间呈良好的线性关系。在0.20～1.00 mL/mL添加白藜芦醇后的丹阳黄酒对ABTS自由基清除率明显比普通黄酒高，两值相差10%以上，说明白藜芦醇丹阳黄酒对ABTS自由基的清除能力大于普通丹阳黄酒。

图3 不同的丹阳黄酒及VC对ABTS自由基清除能力Fig.3 Scavenging capacities of different DanyangHuangjiuand VC on ABTS free radical

3种样品ABTS自由基清除IC50值见表3。由表3可知，IC50值从小到大排列为白藜芦醇丹阳黄酒（0.51 mL/mL）＜维生素C（0.65 mL/mL）＜普通丹阳黄酒（0.80 mL/mL），说明对于ABTS自由基，白藜芦醇丹阳黄酒清除能力比维生素C溶液和普通丹阳黄酒都强。

表3 三种样品的DPPH自由基清除率IC50值Table 3 IC50values of three samples for scavenging DPPH

2.4 总抗氧化能力

将0.10mg/mL白藜芦醇丹阳黄酒、0.10mg/mL维生素C溶液和不含白藜芦醇的丹阳黄酒分别进行梯度稀释，比较3种样品对铁氰化钾的还原力，即总抗氧化能力，结果见图4。

图4 不同的丹阳黄酒及VC总抗氧化能力比较Fig.4 Comparison of total antioxidant activities of different DanyangHuangjiuand VC

由图4可知，三种样品的铁氰化钾还原力均呈线性增长趋势。相同酒样添加量下，新型丹阳黄酒的还原力明显高于普通黄酒，且酒样添加量越大，新型黄酒与普通丹阳黄酒的吸光度值相差越大，但维生素C的吸光度值始终高于两种丹阳黄酒，说明在总抗氧化能力上，维生素C的溶液的抗氧化能力高于两种黄酒，白藜芦醇丹阳黄酒高于普通丹阳黄酒。

2.5 新型丹阳黄酒稳定性

添加白藜芦醇质量浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的丹阳黄酒，室内未避光常温密封放置60 d，分别于0、3 d、6 d、12 d、24 d、36 d、48 d、60 d用HPLC测定新型丹阳黄酒中的白藜芦醇含量，结果见图5。由图5可知，新型黄酒中的白藜芦醇含量在前3 d降解快速，3～60 d降解速度减小趋于平缓，初始质量浓度分别为100 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL的白藜芦醇丹阳黄酒在60 d时白藜芦醇的浓度分别下降到23.12 μg/mL、9.34 μg/mL、3.40 μg/mL、1.43 μg/mL。说明白藜芦醇在黄酒中的稳定性不佳，可能会影响到白藜芦醇黄酒的抗氧化活性。因此，新型丹阳黄酒的开发也会进一步深入研究如何提高白藜芦醇稳定性，来保证新型黄酒产品的功能。

图5 不同浓度的新型丹阳黄酒中的白藜芦醇浓度变化Fig.5 Changes of resveratrol concentration in new types of Danyang Huangjiuwith different resveratrol concentrations

3 结论

结果表明，加入白藜芦醇后的丹阳黄酒比普通的丹阳黄酒总抗氧化能力强，而且高于相同浓度的维生素C溶液，在DPPH自由基清除能力上，新型黄酒也高于普通黄酒，在羟自由基和ABTS自由基清除能力上，只有当酒样添加量＞0.2mL/mL时，新型黄酒高于普通黄酒。以上结果说明，质量浓度为0.10 mg/mL的白藜芦醇丹阳黄酒的抗氧化能力比普通丹阳黄酒有了明显的提高。但新型丹阳黄酒中白藜芦醇稳定性较差，因此，需要进一步研究如何降低环境对丹阳黄酒中白藜芦醇的影响，提高白藜芦醇在黄酒中的稳定性。