酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇的提取及抗氧化、抗肿瘤活性研究

王虹玲，吴 优，于子箫，康振宇，赵奕彭，康宗利*

（1.沈阳工学院 生命工程学院，辽宁 抚顺 113122；2.沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866；3.西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

酿酒葡萄皮渣中含有大量与葡萄酒类似的生物活性物质，尤以多酚类化合物为主（如白藜芦醇、原花青素、酒石酸等），这些物质都具有较强的抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗衰老等生物活性，已成为世界性的重要营养兼药用的商品[1-5]。白藜芦醇是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，主要存在于葡萄属、花生属等植物中，以虎杖、葡萄中含量最多，而在葡萄中又以葡萄皮中的含量最高[6-10]。

目前，白藜芦醇提取常见的方法有有机溶剂提取法、超声波提取法、微波辅助法、酶解法等。由于自然界中白藜芦醇的含量较低，通常在提取前需要对提取对象进行生物转化，如将样本中的白藜芦醇苷和白藜芦醇多聚体衍生物通过酸碱水解或酶解转化为白藜芦醇，可大大提高白藜芦醇提取率[11-12]。

本研究以自酿葡萄酒发酵后的皮渣为原材料，将皮渣干燥后磨粉过筛，利用纤维素酶解法在不同条件下进行白藜芦醇的提取，并对提取得到的白藜芦醇进行抗氧化及体外抗肿瘤活性分析，以期为葡萄皮渣资源的利用以及白藜芦醇产品的深度开发奠定理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒葡萄皮渣：康美尔葡萄经葡萄酒发酵后滤出清液所得。人宫颈癌Hela细胞、人肺癌A549细胞、人前列腺癌PC-3细胞：均由中国医科大学提供。

白藜芦醇标准品（色谱纯），纤维素酶（酶活105U/g）、邻二氮菲、亚硝酸钠、硫酸亚铁、1,1-二苯基-2-硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硝酸铝、乙酸乙酯（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-201D型旋转蒸发仪：予华仪器有限公司；W200IR型CO2培养箱：美国SIM公司；TS-100倒置显微镜：日本Nikon公司；Stat Fax-3200酶标仪：美国AWARENESS公司；1-15K高速冷冻离心机：德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

操作要点：

酿酒葡萄皮渣粉末：新鲜酿酒葡萄皮渣经纱布过滤去除残余水分后，50℃烘干至质量恒定，经粉碎机粉碎，过40目筛，得到的皮渣粉，末加入石油醚进行脱脂处理；旋转蒸发去除石油醚，得到的葡萄皮渣粉末装入密封容器内备用。

纤维素酶解：准确称取酿酒葡萄皮渣粉末1.0g于100mL烧杯中，加入一定量的蒸馏水和纤维素酶在50℃、pH 5.0条件下酶解1 h。

体积分数95%乙醇浸提：酶解后加入一定量体积分数95%的乙醇，浸提一段时间后离心去除滤渣。

白藜芦醇粗提液：滤液经旋转蒸发去除乙醇，得到白藜芦醇粗提液。

白藜芦醇浸膏：白藜芦醇粗提液中加入乙酸乙酯，反复萃取3次，合并乙酸乙酯相，旋转蒸发去除乙酸乙酯，得到白藜芦醇浸膏。

目标产物：白藜芦醇浸膏于50℃条件下烘干至质量恒定，进行含量测定。

1.3.2 白藜芦醇提取工艺优化的单因素试验

以酿酒葡萄皮渣为原料，分别以纤维素酶添加量（30U/μL、50U/μL、70U/μL、90U/μL、110U/μL、130U/μL）、体积分数为95%乙醇与葡萄皮渣液固比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL∶g））、酶解时间（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）、酶解温度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70℃、80℃）为评价因素，白藜芦醇提取率为评价指标，进行酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇提取的单因素试验。

1.3.3 白藜芦醇提取工艺优化的响应面试验

在单因素试验的基础上，根据中心组合设计（central composite design，CCD）的设计原理，利用Design Expert 8.0.6.1软件进行响应面设计，以酶添加量（A）、液固比（B）、酶解时间（C）、酶解温度（D）为考察因素，以酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇提取率（Y）为评价指标优化酶解条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1 酿酒葡萄皮渣酶解条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

1.3.4 测定方法

白藜芦醇含量：参照文献[13]的方法进行测定；

DPPH自由基清除能力：以维生素C（vitamin C，VC）作为对照，参照文献[14]的方法进行测定；

超氧阴离子自由基清除能力：以VC作为对照，参照文献[15]的方法进行测定；

体外抗肿瘤活性：参照文献[16]的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇提取工艺优化的单因素试验结果

2.1.1 酶添加量对酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇提取率的影响

图1 纤维素酶添加量对白藜芦醇提取率的影响Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of resveratrol

由图1可知，白藜芦醇提取率随酶添加量的增加呈现先升高后平稳的趋势；当酶的添加量为70 U/μL时，白藜芦醇提取率达到最高，为142.82 μg/g。继续增加酶添加量，葡萄皮渣中白藜芦醇的提取率并没有明显提高。表明此时溶液中酶的添加量已近于饱和。因此，选择酶添加量为70 U/μL进行后续试验。

2.1.2 液固比对酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇提取率的影响

由图2可知，白藜芦醇提取率随液固比的增加呈现先升高后降低的趋势；当液固比为25∶1（mL∶g）时，白藜芦醇提取率达到最高，为139.82 μg/g。继续增加液固比，反应体系中酶的浓度逐渐稀释，降低了酶解作用效果，导致白藜芦醇提取率逐渐降低。因此选择液固比为25∶1（mL∶g）。

图2 液固比对白藜芦醇提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of resveratrol

2.1.3 酶解时间对酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇提取率的影响

图3 酶解时间对白藜芦醇提取率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of resveratrol

由图3可知，白藜芦醇提取率随酶解时间的延长呈现先升高后平稳的趋势；当酶解时间为90 min时，白藜芦醇提取率达到最高，为142.48 μg/g。继续增加酶解时间，葡萄皮渣中白藜芦醇的提取率并没有明显提高。此时，细胞壁已基本被破坏，再延长酶解时间对试验效果影响不显著（P＞0.05）。因此选择酶解时间为90 min。

2.1.4 酶解温度对酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇提取率的影响

图4 酶解温度对白藜芦醇提取率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of resveratrol

由图4可知，白藜芦醇提取率随酶解温度的升高呈现先升高后降低的趋势；当酶解温度为50℃时，白藜芦醇提取率达到最高，为129.63 μg/g。当酶解温度＞50℃时，酶的活性受到严重影响，高温破坏了酶的结构，影响了酶对细胞壁的分解作用，抑制了白藜芦醇的提取。因此，选择酶解温度为50℃。

2.2 响应面分析法优化葡萄皮渣中白藜芦醇的提取工艺

2.2.1 回归模型的建立及方差分析

响应面试验结果与方差分析分别见表2和表3。

表2 酿酒葡萄皮渣酶解条件优化响应面分析试验结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

从表3可以看出，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），模型调整系数R2Adj=0.9193，R2=0.9583，表明该模型与试验拟合较好，可以用于葡萄皮渣中白藜芦醇提取率的预测。从回归方程系数显著性检验可知，各试验因素对白藜芦醇提取率的影响为A＞B＞C＞D，交互项除AD外其余各项均极显著（P＜0.01），二次项除C2外均极显著（P＜0.01）。模型所预测的最优提取条件为酶添加量70.16 U/μL，酶解时间148.43 min，酶解温度39.80 ℃，液固比18.16∶1（mL∶g），在此条件下，白藜芦醇的提取量为141.48 μg/g。

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 Variance analysis results of regression model

对各试验点的响应值进行多元回归拟合，得到回归模型方程为：Y=139.46+5.76A-4.91B+1.20C-0.78D+3.98AB+4.13AC+2.01AD+-9.84BC-4.98BD-5.46CD-5.36A2-3.99B2-1.29C2+2.48D2

2.2.2 交互作用分析

酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇提取工艺优化的响应面及等高线图如图5所示。

由图5可知，酶添加量和液固比的交互作用对白藜芦醇的提取量影响极显著（P＜0.01）；在一定的液固比条件下，提取量随酶添加量的增大呈先增大后减小的趋势。酶添加量和酶解时间的交互作用对白藜芦醇的提取量影响极显著（P＜0.01）；在不同的酶解时间下，提取量随酶添加量的升高而逐渐降低。固液比和酶解温度的交互作用对白藜芦醇的提取量影响极显著（P＜0.01）；在一定酶解温度条件下，提取量随液固比的增大呈先增大后减小的趋势。酶解时间和酶解温度的交互作用对白藜芦醇的提取量影响极显著（P＜0.01）；在一定的酶解温度下，提取量随酶解时间的增大呈逐渐减少的趋势。液固比和酶解时间的交互作用对白藜芦醇的提取量影响极显著（P＜0.01）；在不同的液固比条件下，提取量随酶解时间的增大而逐渐减少。

图5 酶添加量、酶解时间、酶解温度、液固比交互作用对酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇含量影响的响应曲面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between cellulase addition,enzymolysis time,temperature and solid-liquid ratio on resveratrol content from wine grape pomace

2.2.3 最佳提取条件验证试验

根据响应面优化得到的结果，结合实际试验操作，将考察因素设定为酶添加量为70 U/μL，酶解时间为150 min，酶解温度为40 ℃，液固比为20∶1（mL∶g），重复3次试验，得到葡萄皮渣中白藜芦醇的提取率为144.13 μg/g，与模型预测值141.48 μg/g接近，证实了模型的有效性。

2.3 葡萄皮渣中白藜芦醇的抗氧化活性分析

由图6A可知，VC和白藜芦醇均对DPPH自由基有较强的清除效果，且清除率随抗氧化剂浓度的增加而呈上升趋势。其中VC在试验范围内对DPPH自由基的清除效果优于白藜芦醇，当质量浓度为1.2 mg/mL时，VC的清除率可达（88.03±2.251）%，白藜芦醇的清除率为（65.12±3.882）%。

图6 不同质量浓度的VC及白藜芦醇对DPPH（A）和超氧阴离子（B）自由基的清除效果Fig.6 Scavenging capacities of different concentrations of VC and resveratrol on DPPH free(A)and superoxide anion(B)free radicals

由图6B可知，不同浓度的白藜芦醇均具有一定的清除超氧阴离子自由基的能力，并随质量浓度的不断增大，清除率逐渐升高，当质量浓度为1.2mg/mL时白藜芦醇对超氧阴离子自由基的清除率达到最大，为（54.13±3.105）%，阳性对照VC对超氧阴离子自由基的最大清除率为（86.58±2.975）%。白藜芦醇对超氧阴离子自由基的抗氧化性虽不及VC，但也表现出一定的清除效果。

2.4 葡萄皮渣中白藜芦醇的体外抗肿瘤活性分析

采用MTT法测定葡萄皮渣中白藜芦醇对3种癌细胞Hela、A549和PC-3的体外抑制活性，并根据抑制率计算半抑制浓度（50%inhibiting concentration，IC50）值，结果见表4。

表4 白藜芦醇对3种肿瘤细胞株的IC50值Table 4 IC50value of the three tumor cell strains treated with resveratrol

由表4可知，白藜芦醇对前列腺癌PC-3细胞的抑制最为显著，IC50值最小，为25.31 μmol/L；对Hela细胞和A549细胞的IC50值分别为128.29 μmol/L和108.35 μmol/L。

3 结论

本研究采用纤维素酶水解法对酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇的提取工艺进行优化，确定最优提取条件为酶添加量70 U/μL，酶解时间150 min，酶解温度40 ℃，液固比20∶1（mL∶g），重复3次试验，得到葡萄皮渣中白藜芦醇的提取率为144.13 μg/g。

抗氧化试验结果显示，酿酒葡萄皮渣中白藜芦醇对DPPH自由基和超氧阴离子自由基均具有较好的清除作用，在试验浓度范围内，清除率随浓度的增加而升高。当样品质量浓度为1.2 mg/mL时，对DPPH和超氧阴离子自由基的清除率达到（65.12±3.882）%和（54.13±3.105）%，表现出较强的抗氧化活性。

体外抗肿瘤试验结果表明，酿酒葡萄皮渣中的白藜芦醇对Hela、A549和PC-3细胞的增长具有抑制作用，其IC50值分别为128.29μmol/L、108.35 μmol/L和25.31 μmol/L，表现出一定的体外抗肿瘤活性。