响应面法优化茯苓多糖发酵培养基

邹成梅，王甜甜，何思艳，田珍燕，郑永良，占剑峰，王蔚新，吴 鹏*

（黄冈师范学院 生命科学学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室 大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄冈 438000）

茯苓（Poria cocos），是拟层孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，常寄生在松树根上，形如甘薯，球状，外皮淡棕色或黑褐色，内部粉色或白色[1]。茯苓的药用部位是茯苓菌核，茯苓多糖是茯苓的主要有效成分[2-3]。茯苓多糖分为水溶性多糖和碱溶性多糖，不溶于乙醇、丙酮和乙醚，其结构是50个β-（1→3）结合的葡萄糖单位，每个β-（1→5）结合的葡萄糖基支链与l～2个β-（1→6）结合的葡萄糖基间隔[6-7]。

经过多年的发展，茯苓已广泛应用于医药及保健食品领域方面，茯苓多糖的消耗也日趋增大，茯苓多糖提取的工艺也在不断优化[8-9]。茯苓的生产可分为固体培养与液体发酵，国内多采用固体培养茯苓，以此来提取多糖，但该法存在木材消耗大、产量不高、生产周期较长等诸多问题。而液体发酵能够连续地大规模进行工业化生产，大大缩短生产时间[10]，液体发酵也可通过工艺控制，使微生物在最适宜的温度、酸碱度、溶氧水平和碳氮比等条件下生长，使其新陈代谢旺盛，在短期内获得大量预期的代谢产物。因此，国内外采用液体发酵来获得茯苓多糖的方式，已成为现在工业化生产的新方向。廖彦[11]在6 L发酵罐中液态发酵培养，茯苓菌生物量、胞内外多糖含量均于第11天达到最大值，分别为3.44 g/L、17.25 mg/g、1.58 g/L；李羿等[12]探讨了茯苓摇瓶补料和发酵罐补料培养的发酵工艺，在5 L发酵罐发酵中，茯苓多糖的产量达到0.23mg/mL。但目前茯苓多糖产量均无法达到工业化生产要求。

本研究采用PB试验[13-16]和响应面法（response surface methodology，RSM）优化[17-19]茯苓产粗多糖的发酵培养基组分，以期提高茯苓粗多糖的产量。通过液态发酵生产茯苓粗多糖，在一定程度上节约成本，提高发酵效率，为体外研究多糖成分抗氧化活性提供基础条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与试剂

茯苓（Poria cocos）：黄冈九资河。

葡萄糖、硝酸钠、无水氯化钙、维生素B1（vitamin B1，VB1）（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；酵母粉（生化试剂）：上海瑞永生物科技有限公司；蛋白胨、琼脂粉（均为生化试剂）：生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；硫酸镁（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司。

1.1.2 培养基

普通固体培养基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨7.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，琼脂粉20 g/L，121℃条件下灭菌20 min。

种子液体培养基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨7.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，121℃条件下灭菌20 min。

初始发酵培养基：葡萄糖40 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸镁1.67 g/L，蛋白胨30 g/L，硝酸钠5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，VB11 g/L，无水氯化钙0.1 g/L，121℃条件下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）股份有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；LX-B50L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：合肥华泰医疗设备有限公司；RB-CJ-1ND型超净工作台：北京瑞邦兴业科技有限公司；SPX-150生化培养箱：中仪国科（北京）科技有限公司；TG16-WST台式高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；FD系列冷冻干燥机：上海拓纷机械设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化、纯化及培养条件

活化：采用无菌移液枪吸取2%的茯苓菌种于种子液体培养基内进行液体发酵，在26.5℃的恒温培养箱中培养3d。

筛选及纯化：将活化的菌种分梯度稀释，用无菌移液枪吸取活化好的菌液1mL，放入9mL的无菌水中即为10-1稀释液，如此重复，依次制成10-2～10-8的稀释液，将10-5～10-84管稀释液各取0.2 mL，接种于普通固体培养基中，26.5℃条件下培养，挑选好的单菌落通过划线法再次得到纯种，单个纯种斜面培养3 d，挑取菌种于种子液培养基中培养3 d，测定菌株的茯苓粗多糖产量，挑选产量最高的菌种进行培养和后续试验。

种子液：按2%接种量接种于种子液体培养基中，于26.5℃温度下，液体发酵3 d，得种子液，并保种冷藏。

发酵培养：按2%的接种量，将种子液接种于50 mL的初始发酵培养基中，于26.5℃的恒温培养箱中培养3 d。

1.3.2 茯苓粗多糖产量的测定

将培养3d后的50mL菌液在旋转蒸发仪中浓缩至15mL，加入40 mL的体积分数95%的乙醇溶液醇沉，过滤后在沉淀中加入60 mL的蒸馏水，放入离心管中，经3 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中再加入20 mL蒸馏水，继续离心10 min，弃上清，将沉淀置于培养皿中，真空干燥24 h，称质量，得到茯苓粗多糖。

1.3.3 Plackett-Burman试验设计

Plackett-Burman（PB）试验设计是响应面试验设计的一种，用于中心组合试验之前挑选优化因素的一种试验设计方法。参考文献[20-22]，选择影响茯苓粗多糖产量的8个因素葡萄糖（A）、酵母粉（B）、蛋白胨（C）、硝酸钠（D）、磷酸二氢钾（E）、硫酸镁（F）、VB1（G）和无水氯化钙（H），以茯苓粗多糖产量（Y）为响应值，选取N=12的PB试验设计对影响茯苓粗多糖产量的8个因素的显著性进行考察，将每个因素分为高（+1）、低（-1）2个水平，其中高水平是低水平的1.5倍。PB试验设计因素与水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.4 最陡爬坡试验设计

在PB试验的基础上，根据各因素的效应值来选择合适的步长，用来快速找出最佳区域，变化方向均由效应值的正负确定，正效应的因素应取低值依次增大，负效应的因素应取高值依次减小。经最陡爬坡试验得到茯苓粗多糖产量的因素拐点，作为下一步响应面分析的中心点。

1.3.5 响应面分析试验设计

根据最陡爬坡试验的结果，得到Box-Behnken试验的中心点，以相邻的上下两个实际步长为高低水平，以茯苓粗多糖产量（Y）为响应值，对茯苓粗多糖产量的影响因素葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）、硫酸镁（X3）进行响应面分析试验，得到最优方案。响应面试验设计因素与水平见表2。

表2 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验结果

按PB试验设计进行试验，PB试验设计与结果见表3，各因素主效应分析试验结果见表4。

表3 Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman试验的效应分析Table 4 Effect analysis of Plackett-Burman experiments

由表4可知，8个因素中贡献值最大的3个因素分别是葡萄糖、硫酸镁和酵母粉，其可信度均在95%以上，对结果呈显著影响（P＜0.05）。因此，选择葡萄糖、硫酸镁和酵母粉添加量作为主要影响因素进行下一步试验。

2.2 最陡爬坡试验设计及结果

经过PB试验后，选择3个主要效应因素葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）、硫酸镁（X3）进行最陡爬坡试验，确定最佳水平范围，最陡爬坡试验设计及结果见表5。

由表5可知，当葡萄糖添加量为50 g/L、酵母粉添加量为20 g/L和硫酸镁添加量为2.0 g/L时，茯苓粗多糖产量最高，因此选择第4组试验作为Box-Behnken试验的中心点，进行Box-Behnken试验。

表5 最陡爬坡试验设计Table 5 Design of the steepest climbing experiments

2.3 响应面试验优化

2.3.1 响应面试验设计与结果

在PB试验和最陡爬坡试验基础上，应用Design-Expert 8.0软件，以茯苓粗多糖产量（Y）作为响应值，对葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）和硫酸镁（X3）添加量3个因素进行3因素3水平的Box-Behnken试验，Box-Behnken试验设计及结果见表6，回归模型方差分析结果见表7。

表6 Box-Behnken试验设计及结果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

运用Design-Expert8.0软件对各因素进行二次多项式回归拟合后，得到茯苓粗多糖产量高低响应面回归模拟方程：

由表7可知，该回归模型的影响极显著（P＜0.01），其中X1对响应值的影响显著（P＜0.05），X1X2、X12、X22对响应值的影响极显著（P＜0.01），其他项影响均不显著（P＞0.05）。失拟项P值为0.568 7＞0.05，不显著，表明模型符合实际情况，可以用此模型对茯苓粗多糖的产量进行分析和预测。

表7 回归模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

2.3.2 响应面分析及验证

应用Design-Expert 8.0软件获得葡萄糖、酵母粉、硫酸镁添加量3个因素交互作用对茯苓粗多糖产量影响的响应面和等高线，结果见图1。由图1可知，葡萄糖与酵母粉交互作用等高线中心区域呈椭圆形，表明两因素存在明显的交互作用。所有响应面图形坡面陡峭，方程的抛物线图形开口全部向下，即最大值存在，响应面覆盖最大值所在区域。

根据回归模拟方程可以算出茯苓粗多糖产量的最大预测值为142.5 mg/100 mL，此时培养基的主要成分及添加量为：葡萄糖47.12 g/L、酵母粉20.53 g/L、硫酸镁1.81 g/L、蛋白胨30 g/L、硝酸钠5 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、VB11 g/L、无水氯化钙0.1g/L。为方便实际操作，修改培养基成分为葡萄糖47.1g/L、酵母粉20.5g/L、硫酸镁1.8 g/L、蛋白胨30 g/L、硝酸钠5 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、VB11 g/L、无水氯化钙0.1g/L。按此培养基成分进行试验，得到茯苓粗多糖的产量为138 mg/100 mL，与模型预测值相接近，较初始发酵培养基，茯苓粗多糖是优化前的1.3倍。

图1 葡萄糖、酵母粉和硫酸镁添加量交互作用对茯苓粗多糖产量影响的响应面及等高线Fig.1 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between glucose,yeast powder and magnesium sulfate addition on the yield of crude polysaccharide fromPoria cocos

3 结论

根据PB试验结果从8个因素中选择了具有重要效应的3个因素葡萄糖、酵母粉和硫酸镁作为主要影响因素。经过Box-Behnken试验设计及响应面分析，对培养基的组分优化，确定了最优培养基成分为：葡萄糖47.1 g/L、酵母粉20.5 g/L、硫酸镁1.8 g/L、蛋白胨30 g/L、硝酸钠5 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、VB11 g/L、无水氯化钙0.1 g/L。在此最优发酵培养基条件下，茯苓粗多糖产量为138 mg/100 mL，是优化前（102 mg/100 mL）的1.3倍。