几丁质脱乙酰酶高产菌株的选育及其发酵特性研究

魏丽蓉，秦汪艳，李永成*

（海南大学 食品学院，海南 海口 570228）

几丁质（chitin）是一种由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键聚合而成的高聚物，是地球上含量仅次于纤维素的可再生天然多糖[1]，它主要存在于海洋无脊椎动物的甲壳和骨组织以及真菌和植物的细胞壁中，在虾、蟹等水产品加工废弃物中尤为丰富。几丁质化学结构稳定，其弱降解性和低溶解性严重制约了它在各行各业的的应用[2]。壳聚糖（chitosan）是几丁质脱去乙酰基后形成的一种低分子衍生物，因其含有大量游离氨基和碱性阳离子而比几丁质具有更好的溶解性[3]和生物可降解性[4]。此外，壳聚糖具有抗菌性、吸附性和低胆固醇等优良特性，在食品、医药、轻纺、印染、环保和农业等领域应用广泛[5]。

目前，壳聚糖的制备主要通过浓碱热解脱去几丁质的乙酰基，该法存在严重的环境污染问题，且脱乙酰的过程难以控制，使壳聚糖产品的脱乙酰程度不一致，导致产品品质均一性差[6]。几丁质脱乙酰酶（chitindeacetylase，CDA）可水解脱去几丁质的乙酰基，是一种新型的酶法生产壳聚糖的方法，其反应条件温和，环保以及催化过程的可控性逐渐受到重视。该酶最初是由ATAKI Y等[7]从接合菌纲（Zygomycetes）的毛霉属真菌（Mucorrouxii）中发现，此后研究者又从细菌、昆虫甚至放线菌也发现了这种酶。DAI DH等[8]研究了培养基的组成成分和初始pH对类芽抱杆菌属（Bacillusspp.）菌株Hul产CDA情况的影响，优化后的酶活力为0.6 U/mL。ZHANG H等[9]运用Plackett-Burman（P-B）设计对一株产几丁质酶的日本根霉菌M193的产酶条件进行优化，使得酶活力提升为0.55 U/mL。研究表明目前野生菌株CDA的产量仍然处于很低的水平。KAFETZOPOULOS D等[10]克隆M.rouxii、C.lindemuthianum来源的CDA基因并分别在大肠杆菌（Escherichia coli）和巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）中成功表达。KADOKURAK等[11]克隆副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）KN1699来源的CDA编码区及信号肽ORF，在E.coli宿主细胞中异源表达，获得高浓度的CDA产物。KANGL等[12]将Collettotrichumlindermuthianum来源的CDA基因与pHBM905A克隆载体连接后，导入Pichia pastoris中表达，获得的CDA酶活力达到77.27 U/mg。虽然基因工程目的性强，可获得高产CDA诱变菌株，但其工作量大，技术难度较高。而诱变育种是通过人工诱变的方法使微生物发生基因突变，通过筛选获得产量高、性能优良的突变体。这种方法简便易行，且变异体稳定性好，能较好地提高代谢产物产量[13]。因此，本研究以实验室保存的一株海洋丝状真菌（Penicillium janthinellum）UV-0S为出发菌株，通过多级紫外诱变获得一株高产CDA的菌株，并对其发酵特性和CDA脱乙酰度（deacetylation degree，DD）机制进行研究，以期为酶法制备壳聚糖提供优良菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

海洋丝状真菌（Penicillium janthinellum）UV-0S：本实验室从中国海口东寨港红树林土壤中筛选获得。

1.1.2 试剂

磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、氢氧化钠、硫酸镁等（均为分析纯）：广州化学试剂厂；几丁质（生化试剂）：上海源叶生物科技有限公司；对硝基乙酰苯胺（纯度＞99.0%）：上海梯希爱化成工业发展有限公司。

1.1.3 培养基

斜面培养基：采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，氯化钠1.0%。

种子培养基：葡萄糖0.25%，酵母浸膏0.5%，磷酸二氢钾0.15%，硫酸铵0.4%，氯化钠1%，初始pH 6.0。

发酵培养基：葡萄糖0.4%，酵母浸膏0.5%，磷酸二氢钾0.15%，氯化钠1%，胶体几丁质0.1%，初始pH 6.0。

筛选培养基：葡萄糖0.25%，酵母浸膏0.5%，硫酸镁0.05%，氯化钠0.8%，磷酸二氢钾0.03%，磷酸氢二钾0.7%，胶体几丁质0.1%，对硝基乙酰苯胺0.2%，琼脂2%，初始pH6.0。

所有培养基在121℃条件下高压蒸汽灭菌16 min。

胶体几丁质：将2g几丁质粉末加入至40 mL浓盐酸中，搅拌至其完全溶解，然后加入200 mL提前预冷的体积分数为50%的乙醇水溶液，搅拌2 h，4℃静置过夜。8 000 r/min离心20 min，收集沉淀，采用去离子水反复洗涤至胶体几丁质呈中性。

1.2 仪器与设备

LRH-250生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；HZQ-X300摇床：上海一恒科学仪器公司；LGJ-12A冷冻干燥机：军事医学科学院实验仪器厂；YXQ-LS高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用有限公司；TENSOR27傅立叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FT-IRDUI）仪：德国布鲁克公司。

1.3 方法

1.3.1 培养条件

菌株活化：菌株于斜面培养基上，30℃培养5～6 d，待产孢后，用5 mL 0.9%生理盐水刮下孢子，调整孢子悬浮液浓度为1×107CFU/mL。将上述孢子悬液转接到装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min摇床振荡培养36 h。

种子液的制备：将上述孢子悬液转接到装有50mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min振荡培养36 h。

摇瓶发酵：种子液按2%（V/V）的接种量接种于装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min培养72 h。

1.3.2 多级紫外线诱变

斜面中加入10 mL 0.9%的无菌生理盐水，刮下孢子制成孢子悬浮液，并将其浓度调整为1×108CFU/mL。取8 mL孢子悬浮液于无菌培养皿中，置于紫外灯下照射处理（30W，平皿垂直上方30 cm处）。在150～300 s的时间范围内，每30 s取出0.1 mL上述紫外线处理液，涂布于筛选培养基上，30℃培养3～5 d。根据菌落周围黄色透明圈直径大小筛选出正突变体菌株[14]。选取CDA酶活较高的菌株按上述方法进行二次紫外诱变处理，筛选获得CDA酶活最高的菌株。

1.3.3 CDA粗酶液的制备

发酵液于4℃条件下抽滤，滤液即为胞外粗酶液。在抽滤所得的菌丝体中加入预冷的0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.0）和石英砂，在低温条件下快速碾磨，浆液立即在4℃、6 000 r/min离心20 min，所得上清液即为胞内粗酶液。

1.3.4 发酵特性试验

发酵特性曲线的测定：按2%（V/V）的接种量接种于装液量为50 mL/250 mL的发酵培养基中，30℃、180 r/min条件下培养，每隔12 h取样一次，测定菌丝体干质量、残糖量及CDA酶活力，考察最优突变株的发酵特性。

以发酵培养基为基础培养基，接种量为2%（V/V）、装液量为50mL/250mL，考察不同初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、浓度为11 mmol/L[15]的无机盐种类（MgSO4、FeCl3、CaCl2、BaCl2、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、NaH2PO4、KH2PO4）、胶体几丁质添加量（0、0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%）对最优突变菌株产CDA的影响。

1.3.5 细胞壁几丁质的制备

发酵液过滤后获得菌丝体，去离子水反复洗涤菌丝体至上清液无残留葡萄糖。将菌丝体浸没于0.5 mol/L NaOH料液比1∶40（g∶mL），经400 W超声30 min，除去菌丝体的蛋白质。破碎的细胞壁依次经过0.1 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、二甲基亚砜、体积分数为95%的乙醇水溶液料液比1∶40（g∶mL）进行脱钙处理，细胞壁几丁质经去离子水反复洗涤至中性后，冷冻干燥至质量恒定[16]。

1.3.6 测定方法

（1）CDA酶活力的测定：参照文献[17]。

（2）残糖量的测定：采用二硝基水杨酸法（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[18]测定还原糖的含量。

（3）菌丝体干质量的测定：将发酵液真空抽滤后，收集菌丝体，菌丝体用蒸馏水反复洗涤后，60℃烘干至恒质量，测其干质量。

（4）细胞壁几丁质脱乙酰度的测定：采用傅里叶变换红外光谱测定细胞壁几丁质的脱乙酰度[19]。取2 mg干燥后的样品与150 mg溴化钾充分研细后，用压片机压片。以相同质量的溴化钾压片为对照，扫描波数为500～4000cm-1的透光率。几丁质的脱乙酰度（DD）计算公式为[20]：

式中：A1560、A2880分别为波数1 560 cm-1和2 890～2 925 cm-1的峰面积；0.813为A1560/A2880线性系数；1.152：不同脱乙酰度几丁质红外扫描后A1560/A2880所作曲线的k值。

2 结果与分析

2.1 多级紫外线诱变

挑取经两次诱变处理后的正突变菌株UV-1S、UV-2S、UV-3S、UV-4S、UV-5S、UV-6S、UV-7S，接种于斜面培养基，30℃培养5～6d，随后将这些菌株接种到发酵培养基，30℃，180r/min摇床培养72h。以出发菌株Penicilliumjanthinellum UV-0S为对照，测定正突变菌株胞内和胞外的CDA酶活力，正突变菌株的CDA酶活力测定结果见表1。由表1可知，UV-3S菌株的胞外CDA酶活力最高，为（11.05±0.18）U/mL，是原始菌株UV-0S的2.1倍，将突变菌株UV-3S经过6次传代测定其产酶稳定性，结果显示突变株UV-3S每一代均可稳定产酶，酶活稳定在10.87～11.25 U/mL，说明该突变菌株具有较好的遗传稳定性[21]。

表1 正突变菌株胞内、胞外CDA酶活力比较Table 1 Comparison of extracellular and intracellular CDA activities of positive mutant strains

2.2 发酵特性曲线

菌株UV-0S和突变菌株UV-3S的发酵特性曲线见图1。由图1可知，菌株UV-0S和UV-3S的胞内CDA酶活力远远低于胞外CDA活性，因此后续的研究以胞外CDA计。在0～72 h的生长期内，CDA酶活力增加，发酵72 h后开始下降。UV-0S和UV-3S的生长曲线符合微生物典型的“J”型生长曲线：对数期（24～48 h），真菌生长导致葡萄糖的快速消耗；缓慢生长期（48～72 h），此阶段碳源的消耗速率相对较慢；自噬阶段（84 h之后）。从菌丝生长和CDA合成的过程曲线可知胞外CDA的分泌与菌丝生长呈现耦合关系[22]。

图1 Penicillium janthinellumUV-0S（A）和突变株UV-3S（B）的发酵特性曲线Fig.1 Fermentation characteristic curve ofPenicillium janthinellum UV-0S(A)and mutant strain UV-3S(B)

2.3 初始pH值对突变株UV-3S产CDA的影响

培养基的pH会影响细胞膜所带电荷，从而影响细胞与外界物质交换的速率，因此确定最适的pH对产酶具有重要意义[23]。初始pH值对菌株Penicillium janthinellumUV-0S和突变株UV-3S产CDA和生物量的影响结果见图2，由图2可知，初始pH值为9.0时，CDA活性最高，菌株UV-0S的CDA酶活为6.50U/mL，突变株UV-3S的CDA酶活为16.76U/mL，分析原因可能是酸碱度通过影响CDA合成过程中相关酶及其他相关活性物质的稳定性和生物活性来影响胞外CDA的合成与分泌[24-25]。但此时的细胞生物量最低，表明生物量并不是影响CDA活力的唯一因素。

图2 初始pH值对Penicillium janthinellumUV-0S(A)和突变株UV-3S(B)产CDA和干质量的影响Fig.2 Effect of initial pH value on CDA production and dry mass of Penicillium janthinellumUV-0S(A)and mutant strain UV-3S(B)

2.4 无机盐种类对突变株UV-3S产CDA的影响

图3 无机盐对Penicillium janthinellumUV-0S(A)和突变株UV-3S(B)产CDA和干质量的影响Fig.3 Effect of inorganic salt on CDA production and dry mass of Penicillium janthinellumUV-0S(A)and mutant strain UV-3S(B)

无机盐为微生物生长提供各种重要元素，可作为细胞组分、生理调节物质、酶的激活剂等参与微生物的整个生长代谢过程[26]。不同无机盐对突变株UV-3S产CDA的影响结果如图3所示。由图3可知，添加11 mmol/L NaH2PO4无机盐时，出发菌株UV-0S和突变株UV-3S的CDA酶活力最高，分别5.718 U/mL和10.53 U/mL，分析其原因可能是，Na+对CDA酶有一定的激活作用，或作为该酶的组成部分，对维持酶的活性结构具有重要意义[27]。

2.5 胶体几丁质对突变株UV-3S产CDA的影响

诱导剂是影响酶生物合成的重要因素，CDA是种诱导酶，其合成需要底物几丁质作为诱导物。然而一般的几丁质原料无法溶解于培养基中，使得菌株不能直接利用几丁质[28]。因此，试验将几丁质配制成胶体几丁质使用，探究胶体几丁质对菌株产酶的影响。胶体几丁质对CDA酶活力的影响结果如图4所示。由图4可知，培养基中胶体几丁质添加量为0.2%时，出发菌株UV-0S的CDA酶活达到最大值，为4.42 U/mL。胶体几丁质添加量为0.5%时，UV-3S的CDA酶活力最高，为11.83 U/mL。未添加胶体几丁质时，胞外CDA酶活处于较低水平，添加胶体几丁质后，CDA酶活骤然上升，说明胶体几丁质作为CDA酶合成的底物，对CDA合成有诱导作用。

图4 胶体几丁质的添加量对Penicillium janthinellumUV-0S和突变株UV-3S产CDA和干质量的影响Fig.4 Effect of colloidal chitin addition on the CDA production and dry mass ofPenicillium janthinellumUV-0S and mutant strain UV-3S

2.6 细胞壁几丁质脱乙酰度的变化

波数3 480 cm-1、2 840～2 962 cm-1分别为-OH和-CH伸缩振动吸收峰[29]，波数1656 cm-1、1 560 cm-1和1 315 cm-1分别为酰胺I、II、III伸缩振动吸收峰。酰胺吸收峰的变化证实了N-脱乙酰的发生，峰面积越小，N-脱乙酰度越高[30]。Penicillium janthinellumUV-0S和突变株UV-3S不同生长时间细胞壁几丁质红外光谱研究结果见图5。由图5可知，出发菌株UV-0S的几丁质1（42 h）、几丁质2（72 h）、几丁质3（96 h）的DD值分别为80.05%、84.01%、90.52%。突变菌株UV-3S的几丁质a（42 h）、几丁质b（72 h）和几丁质c（96 h）的DD值分别为74.04%、76.33%、79.62%。出发菌株UV-0S和突变株UV-3S细胞壁几丁质的DD值随真菌的生长而增加，96 h时DD值最高。此外，出发菌株UV-0S的细胞壁几丁质较突变菌株UV-3S表现出更高的脱乙酰基化程度。几丁质是真菌细胞壁的重要组成部分，细胞壁的生长与CDA有着密切的联系，CDA在真菌发育的所有生命阶段都参与了几丁质多糖的N-脱乙酰化，提高了壳聚糖在细胞壁中的比例，这可能对真菌防御恶化环境或辅助自我防御有积极作用[31]。

图5 Penicillium janthinellumUV-0S(A)和突变株UV-3S(B)不同生长时间细胞壁几丁质红外光谱研究Fig.5 FT-IR spectrum of chitin in the cell wall ofPenicillium janthinellum UV-0S(A)and mutant strain UV-3S(B)with different growth time

3 结论

本研究以本实验室保存的一株海洋丝状真菌UV-0S为出发菌株，经多级紫外诱变获得一株高产CDA的突变菌株UV-3S，其胞外CDA酶活力是出发菌株的2.1倍。经发酵特性研究得出，突变菌株UV-3S与出发菌株UV-0S的发酵特性基本一致，突变株UV-3S产CDA的最适初始pH值为9.0，最适无机盐为NaH2PO4，胶体几丁质最适添加量为0.5%，在此最优条件下，突变株UV-3S的CDA酶活力最高，为11.83 U/mL，说明CDA是一种诱导酶。菌株UV-3S的细胞壁几丁质的DD值随着真菌生长而增加，并在96 h显示最高的N-脱乙酰化。表明CDA可能参与细胞生长的各个阶段中壳聚糖的形成，这有助于细胞壁主要结构的形成，并影响自噬阶段真菌细胞壁的破坏，为进一步了解CDA生产机理提供了理论依据[32]。