一株具有抗菌活性芽孢杆菌HN-7的分离及抗菌活性研究

黄承敏，王蓉蓉，肖 茜，刘成国，周 辉*

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物机体在抵御病原微生物的防御反应中所产生的一类抗微生物与一些恶性细胞的短肽。抗菌肽具有分子质量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广等特点，在食品加工过程中不易受到破坏，同时它又可生物降解生物吸收，因而安全性较高。因此，抗菌肽是一种天然安全的食品防腐剂[1]。芽孢杆菌属（Bacillussp.）是继乳酸菌后产抗菌肽研究比较普遍的一类细菌属。目前，对于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）等产抗菌肽的研究在国内外已有很多报道。其中，蜡样芽孢杆菌（B.cereus）产生的抗菌肽有cerein 7B[2]、cerein 8A[3-5]、cerein MRX1[6]及—cerein 7[7]等。其中，cerein 7对牛链球菌（Streptococcus bovis）、鸟链球菌（Streptococcusavium）、耐万古霉素（vancomycin-resistant）、马链球菌（Streptococcus equines）、耐万古霉素替考拉宁耐药（vancomycin-resistant teicoplanin-resistant）、黄褐色微球菌（Micrococcus luteu）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、酪酸梭状芽胞杆菌（Clostridium butyricum）等革兰氏阳性菌都有很好的抑菌效果[8-10]；cerein 8A对单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）ATCC 7644、大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922和肠炎沙门菌（Salmonella enteritidis）ATCC13076 有很好的抑制作用[11-12]；cerein MRX1对表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）JCM 2414、牛链球菌（S.bovis）JCM5802、无毒李斯特菌（L.innocua）ATCC 3309、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）CCM 1459等菌均有良好的抑制效果[13-15]。

单核细胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）简称单增李斯特菌，是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

基于此，本研究以单增李斯特氏菌（L.monocytogenes）54002为指示菌，从发酵豆制品中分离得到能够抑制单增李斯特氏菌生长的目标菌株，并确定其抑菌物质的化学性质及生物活性，旨在寻找抑菌范围广、性能稳定且无毒害的抗菌肽，为开发新型抗菌肽及其在实际中的应用鉴定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与样品

指示菌单增李斯特菌（L.monocytogenes）54002，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、类干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（E.coli）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）：由本实验室保存。湖南传统发酵豆豉样品：市售。

1.1.2 培养基

发酵培养基为MRS培养基（初始发酵培养基）、指示菌培养基为脑心浸液（brian heart infusion，BHI）液体培养基、BHI固体培养基：北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.3 化学试剂

胃蛋白酶（酶活1200U/g）、胰蛋白酶（酶活50000U/g）、NaOH、HCl（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DNP-9272BS-Ⅲ生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；HH-8数显恒温水浴锅：上海浦东物理光学仪器厂；LDZX-50 FBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；UV-1200紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；TGL-20M离心机：长沙英泰仪器有限公司；雷磁pHs-3C pH计：上海精科实业有限公司；ZWY-240恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的筛选

单核增生李斯特菌菌液制备：将活化过夜的单增李斯特菌按1%接种至50 mLBHI液体培养基中，37℃、150 r/min摇床培养至稳定期，备用。

产抗菌肽芽孢杆菌的初筛：取豆豉样品约25.00g，加入225 mL的无菌生理盐水中，充分振荡后在80℃的水浴中保温30 min，杀死营养细胞，然后制备系列稀释溶液，选取合适稀释度的稀释液，移取0.1 mL涂布于BHI固体平板中，培养过夜。将单增李斯特菌菌液0.1 mL与100 mL溶化后并保持50℃左右的BHI半固体培养基进行混合，混匀后轻轻倒在长有芽孢杆菌菌落的BHI固体培养基上层，待培养基凝固后将平板继续培养20 h，选取有抑菌圈的菌株，进行菌落的挑取，在BHI培养基平板上划线纯化、斜面保存。

1.3.2 复筛

参考O'CONNOR E B等[16]的方法：将单核增生李斯特菌菌液0.1 mL与100 mL溶化后并保持在50℃左右的BHI固体培养基进行混合，倾注平板，待培养基凝固后轻轻放置无菌牛津杯（内径0.6 cm，外径0.8 cm，高1.0 cm），在牛津杯中加入0.2 mL初筛菌的发酵上清液，4℃冰箱中扩散4 h以上，37℃培养12 h，观察抑菌圈大小，测量抑菌圈直径。

1.3.3 酶敏感性实验

将筛选菌株HN-7发酵上清液分装到2个10 mL Eppendorf管中，每管2.0 mL，调至各酶作用的最适pH值（胃蛋白酶最适pH值为2.0、胰蛋白酶最适pH值为8.0），分别在不同的管中加入胰蛋白酶、胃蛋白酶，使其终质量浓度为1mg/mL，37℃处理2 h，再调pH至7.0，进行抑菌实验，对照为未经酶处理的pH7.0的菌株HN-7发酵上清液，比较抑菌圈差异。

1.3.4 热稳定性实验

将菌株HN-7发酵上清液pH调至7.0，分装到8个1.5 mL Eppendorf管中，每管1.0mL，分别做如下处理：100℃、10min，100℃、30min，100℃、90min，121℃、10min，121℃、20min，进行抑菌实验，对照为未作热处理的pH 7.0的菌株HN-7发酵上清液，比较抑菌圈差异。

1.3.5 酸碱稳定性实验

将菌株HN-7发酵上清液分装到6个10 mL Eppendorf管中，每管2.0 mL，用1.2 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液，分别调pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，37 ℃处理2 h，再调pH至7.0，进行抑菌实验，对照为未作酸碱处理的pH 7.0的菌株HN-7发酵上清液，比较抑菌圈差异。

1.3.6 紫外线稳定性实验

将菌株HN-7发酵上清液，调pH至7.0，分别在20 W紫外灯照射（照射距离10 cm）0.5～2.0 h，进行抑菌实验，对照为未作紫外处理的pH 7.0的菌株HN-7发酵上清液，比较抑菌圈差异。

1.3.7 抗菌肽产量与细菌生长关系

在500 mL BHI液体培养基中以1%的接种量接入菌株HN-7在37℃培养。每隔3 h取发酵液，测定其在波长600 nm处的OD600nm值，并测定发酵液中抑菌圈直径。通过发酵液中抑菌圈直径的变化反映抗菌肽产量的变化。

1.3.8 抑菌谱

将菌株HN-7发酵上清液pH调至7.0，对金黄色葡萄球菌（G+）、大肠杆菌（G-）、藤黄微球菌（G+）、枯草芽孢杆菌（G+）、单增李斯特氏菌（G+）等指示菌做抑菌实验，确定抑菌谱。

2 结果与分析

2.1 产抗菌肽芽孢杆菌的筛选

利用琼脂扩散方法，从样品中筛选出一株抑菌效果明显（抑菌圈直径＞牛津杯外径0.8 cm）的芽孢杆菌（Bacillus sp.），命名为菌株HN-7。

2.2 酶敏感性实验

将菌株HN-7的发酵上清液用胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后，调节pH至7.0后，做抑菌实验，结果见表1。

表1 菌株HN-7抗菌肽对酶的敏感性Table 1 Sensitivity of the antibacterial peptides of strain HN-7 to enzymes

由表1可知，未处理的发酵上清液抑菌效果明显，用胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后抑菌活性没消失。胰蛋白酶、胃蛋白酶同属于消化性蛋白酶，能将蛋白质分解成小分子氨基酸，菌株HN-7的发酵上清液在其处理后抑菌圈直径减少，说明此发酵上清液中含有多肽，在胰蛋白酶、胃蛋白酶的作用下分解为氨基酸，结构的变化影响了抑菌活性，而胰蛋白酶抑菌圈直径小于胃蛋白酶抑菌圈直径，说明该上清液对胰蛋白酶更加敏感。实验结果可推测发酵上清液中存在的抑菌物质是脂肽。

2.3 热稳定性实验

将菌株HN-7的发酵上清液pH调至7.0后，用不同的温度处理不同的时间后做抑菌实验，结果见图1。

图1 菌株HN-7抗菌肽的热稳定性Fig.1 Thermos stability of the antibacterial peptides of strain HN-7

由图1可知，菌株HN-7抗菌肽经121℃处理20 min仍具有很强的抑菌活性，抑菌圈直径为1.7 mm，与对照相比仅相差0.1 mm。说明芽孢杆菌HN-7产高热稳定性抗菌肽，这对于今后的工业化生产和食品加工应用将有重要意义。

2.4 酸碱稳定性实验

取菌株HN-7的发酵上清液，用不同的酸碱度处理2 h后，调pH值至7.0，做抑菌实验，结果见图2。

图2 菌株HN-7抗菌肽的酸碱稳定性Fig.2 pH stability of the antibacterial peptides of strain HN-7

由图2可知，菌株HN-7抗菌肽在pH从2～12的范围内抑菌效果较为稳定，在1.5～1.7 cm之间，与对照相比抑菌圈直径仅降低0.1～0.3 cm，表明这种抗菌肽具有较好的酸碱稳定性。

大部分抗菌肽都是在酸性条件下稳定，有的抗菌肽在中性或碱性条件下即会失活。如应用广泛的Nisin，在pH≤2.0的稀盐酸中有高活性，但在pH 5.0时失活40%，pH 6.8时将丧失90%的活力[1]。而菌株HN-7抗菌肽，在酸性中性甚至碱性条件下都有活力，且抑菌活性较高，可满足不同食品基质的酸碱要求，拓宽了它的应用范围。

2.5 紫外线稳定性实验

菌株HN-7对紫外线照射的稳定性试验结果见表2。由表2可知，紫外线对菌株HN-7发酵上清液照射0.5～2.0 h，抗菌活性和未经紫外线处理的无明显差别，与对照相比紫外线处理0.5 h抗菌活性没有变化，紫外线照射处理2.0 h抗菌直径仅降低0.1cm，说明紫外对芽孢杆菌HN-7所产抗菌肽的抗菌活性没有影响。

表2 菌株HN-7抗菌肽对紫外线的稳定性Table 2 Ultraviolet stability of the antibacterial peptides of strain HN-7

2.6 抗菌肽产量与细菌生长关系

为了研究抗菌肽产量变化与细菌生长的关系，连续24h测定菌株HN-7菌的OD600nm值和其发酵液的抑菌圈直径，结果见图3。由图3可知，菌株HN-7的发酵液中抑菌圈变化趋势与细菌的OD600nm值变化基本相同。芽孢杆菌HN-7从3～12 h呈现直线增长，12～18 h缓慢生长，逐步达到稳定期，并在18 h抑菌圈达到最大值1.9 cm，18 h后菌株逐渐进入衰亡期，抑菌圈与OD600nm值都呈下降趋势，因此可以确定菌株HN-7抗菌肽最佳收获期为18 h。

图3 菌株HN-7抗菌肽产量和菌株HN-7生物量的关系Fig.3 Relation of production of antibiotic lipopeptide and biomass of strain HN-7

2.7 抑菌谱的测定

表3 菌株HN-7抗菌肽的抑菌谱Table 3 Antimicrobial spectrum of antibacterial peptides of strain HN-7

由表3可知，菌株HN-7抗菌肽对植物乳杆菌、类干酪乳杆菌等乳酸菌没有抑制作用，而对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌都有的抑制效果，尤其是单增李斯特氏菌。如果抗菌肽作为一种食品防腐剂应用到食品中，在抑制腐败及病原微生物的同时，而又不对食品中的有益菌不产生抑制作用，不仅可以提高抗菌肽的作用效率，同时又能保证食品的品质。

3 结论

本研究从湖南传统发酵豆制品中，筛选出一株具有强抑菌能力的芽孢杆菌（Bacillussp.），经过蛋白酶酶解结合酸碱稳定性和热稳定性等试验，初步推断该菌能产生抗菌肽。菌株HN-7所产抗菌肽在18 h的抑菌圈达到最大值（1.90 cm），pH 2.0～12.0、121℃处理20 min条件下仍有抑菌活性。该抗菌肽具有较广的抑菌谱，不仅能抑制单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，还能抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌。较广的抑菌谱与良好的热稳定性和酸碱稳定性对于这种抗菌肽在食品加工中的应用具有重要意义。