甘松挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤及磷脂酰肌醇3激酶通路的影响

杨 涛, 汪小鹏, 徐李钢, 欧阳斐, 许 涛

(湖北省武汉市第四医院(华中科技大学同济医学院附属普爱医院) 重症医学科, 湖北 武汉, 430034)

中药甘松是败酱科甘松属植物，具有理气止痛、开郁醒脾的功效[1]。动物实验研究[2-4]发现甘松具有对大鼠抗心律失常的作用。研究[5]还发现甘松挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，但其机制尚不明确。甘松挥发油是甘松的有效浓缩成分[6-7], 本研究观察甘松挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤及PI3K通路的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验药物

甘松挥发油购自江西吉平天然植物油有限公司(生产批号: 160808), 按2005年版《中国药典》Ⅰ部附录方法提取, 20 ℃下密度为0.949 kg/L, 甘松醇含量为98.4%。甘松挥发油与二甲基亚砜(DMSO, 购于武汉谷歌生物科技有限公司)按1∶3比例配置后再用生理盐水稀释。

1.2 实验仪器和试剂

心电及有创血压监护仪PHILIP G 80(上海光电仪器有限公司生产); 动物人工呼吸机 ALC V8S型(上海奥尔科特生物科技有限公司生产); 心肌肌钙蛋白(cTnT)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)采用ELISA法检测，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、糖原合成酶激酶(GSK 3β)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)采用Western Blot法检测(武汉谷歌生物科技有限公司提供试剂盒)。

1.3 实验动物和分组

健康清洁级SD大鼠80只(武汉谷歌生物科技有限公司提供, 170010170), 周龄(12.00±1.00)周，体质量(250.00±20.00) g, 雌雄不限。将上述大鼠随机分成5组: ① 假手术组(n=10); ② 缺血再灌注组(IR组)(n=20); ③ 高剂量甘松挥发油(HD)组(n=20), 取0.1 μg/mL甘松挥发油1 mL, 于再灌注前经股静脉缓慢推注; ④ 低剂量甘松挥发油(LD)组(n=20), 取0.001 μg/mL甘松挥发油1 mL, 于再灌注前经股静脉缓慢推注; ⑤ 二甲基亚砜(DMSO)组(n=20), 取0.3‰ DMSO 1 mL, 于再灌注前经股静脉缓慢推注。

1.4 动物缺血再灌注模型建立

采用20%乌拉坦，按1.0～1.5 g/kg剂量对大鼠行腹腔注射，待大鼠麻醉后固定于操作台，取仰卧位。记录心电图，使用动物呼吸机辅助通气。行右侧颈动脉置管监测有创动脉血压。距胸骨左缘剪断第3、4肋骨并打开胸腔，在左心耳与肺动脉圆锥之间找到左冠状静脉并结扎左冠状动脉前降支，当心电图出现ST段抬高、QRS波高大增宽时，视为左冠状动脉结扎成功。在左冠状动脉阻断30 min后，再灌注60 min, 其中假手术组不结扎左冠状动脉。

1.5 指标检验

大鼠血压、心电信息采集: 大鼠麻醉后，在建立心肌缺血再灌注模型前，先行股动脉和静脉穿刺置管，连接有创动脉血压监测仪，排空连接管中空气，并进行大气校零。

标本采集: 实验结束后采集大鼠动脉血，在室温中放置30 min后以4 000转/min离心10 min, 取上层血清检测CK-MB、cTnT; 采血后静脉注射5%伊文思蓝1.5 mL, 待大鼠口唇蓝染，取出心脏并剔除心房和右室组织。将标本置入-20 ℃冰箱20 min后取出，自心尖向心底平行房室沟方向切出相等厚度的5片心肌片，计算其上、下两面的面积。再将切片置于1%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中, 37 ℃温孵30 min。观察到的蓝色区域为非缺血区，白色区域为缺血梗死区，红色区域为缺血未梗死区。左心室面积(LV)为非缺血区、缺血梗死区和缺血未梗死区之和; 缺血区面积(AAR)为缺血未梗死区和缺血梗死区之和; 梗死区面积(IS)为缺血梗死区面积。分别计算缺血区面积百分比=AAR/LV×100%; 梗死区面积百分比= IS/AAR×100%。假手术组不作心梗面积测定; IR组、LD组、HD组、DMSO组各取10只大鼠，按上述实验方式行心肌梗死面积测定。

Western blot: 再灌注结束后，假手术组、IR组、HD组、LD组各10只大鼠，在左侧冠状动脉结扎线以下5 mm处取左心室全层心肌组织1.0 g, 切成非常细小的碎片制成匀浆，经离心后取上清液，用BCA法测蛋白浓度，经灌胶与上样、电泳、转膜后封闭1 h, 稀释一抗，二抗室温下孵育30 min, 用显影、定影试剂进行显影和定影。以β-acting条带为内参照，凝胶图像分析测定Akt/磷酸化Akt (p-Akt)、GSK-3β/磷酸化GSK-3β (p-GSK-3β)、eNOS/磷酸化eNOS (p-eNOS)条带与β-acting条带灰度值，取其比值为相对表达量。

1.6 统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示。各组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组平均动脉压(MAP)和心率(HR)的变化比较

与假手术组比较, IR组、HD组、LD组及DMSO组MAP水平均显著降低(P<0.05), 而IR组、HD组、LD组及DMSO组MAP水平比较无显著差异(P>0.05); 与假手术组比较，IR组、HD组、LD组及DMSO组HR水平均显著降低(P<0.05), 但IR组、HD组、LD组及DMSO组HR水平比较无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组MAP和HR的变化比较

与假手术组比较, *P<0.05。

2.2 各组血清心肌损伤标记物的表达

与假手术组比较, IR组、HD组、LD组及DMSO组血清心肌标记物CK-MB和cTnT水平均较假手术组显著升高(P<0.05); HD组血清心肌标记物CK-MB和cTnT水平较IR组和LD组及DMSO组均显著下降(P<0.05), LD组和DMSO组血清心肌标记物CK-MB和 cTnT水平与IR组比较均无显著变化(P>0.05)。见表2。

表2 各组血清心肌损伤标记物的表达

与假手术组比较, *P<0.05; 与IR组比较, #P<0.05。

2.3 各组大鼠心肌梗死面积百分比比较

IR组、HD组、LD组及DMSO组AAR/LV比较无显著差异(P>0.05); HD组IS/AAR较IR组显著减少(P<0.05); LD组、DMSO组与IR组IS/AAR比较无显著差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠心肌梗死面积 %

与IR组比较, *P<0.05。AAR/LV为缺血区面积百分比,IS/AAR为梗死区面积百分比。

2.4 各组AKT通路蛋白及磷酸化后的表达

各组AKT、GSK-3β、eNOS蛋白表达无显著差异(P>0.05); HD组p-AKT、p-GSK-3β、p-eNOS蛋白表达较IR组显著升高(P<0.05); LD组p-AKT、p-GSK-3β、p-eNOS蛋白表达较IR组无显著差异(P>0.05)。见表4、图1。

表4 各组AKT通路蛋白及磷酸化后的表达

与IR组比较, *P<0.05; 与HD组比较, #P<0.05。

图1 各组AKT通路蛋白及磷酸化后的表达

3 讨 论

缺血后处理是通过反复短暂的缺血再灌注处理后，再灌注缺血心肌细胞能诱导心肌保护作用[8]。药物后处理是指心肌再灌注前通过药物诱发内源性保护作用，从而对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用[9-10]。线粒体通透性转换孔(mPTP)是位于心肌细胞线粒体内膜上的电压和钙离子依赖性通道，正常情况下mPTP处于闭合状态，限制离子和代谢物质自由通过，从而保持线粒体的正常结构和功能，在心肌缺血再灌注时mPTP异常开放，最终线粒体破坏，心肌细胞出现凋亡[11-13]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)为再灌注损伤挽救激酶(RISK)信号通路中的一种。PI3K将细胞外信号传递给AKT并激活, p-AKT进一步促进GSK-3β、eNOS。其中GSK-3β参与心肌细胞凋亡等生命过程，同时磷酸化后的GSK-3β能够抑制mPTP开放，从而减少心肌损伤[14-17]。研究[18-19]还显示线粒体ATP敏感性钾通道也是后处理的重要信号通路，线粒体ATP敏感性钾通道开放可抑制mPTP开放，从而减少心肌损伤。现已明确甘松挥发油能可逆性地抑制心肌细胞膜表面钠离子通道、钾离子通道以及钙离子通道，其作用呈现一定的浓度依赖性[20-22], 但其是否能作用于线粒体通道尚不确定。

本研究检测了假手术组、IR组、HD组及LD组的AKT/p-AKT、GSK-3β/p-GSK-3β、eNOS/p-eNOS蛋白表达水平，发现假手术组、IR组、HD组、LD组AKT、GSK-3β、eNOS表达均无明显差异，但高剂量甘松挥发油组p-AKT、p-GSK-3β、p-eNOS表达明显高于IR组，而低剂量甘松挥发油组p-AKT、p-GSK-3β、p-eNOS的表达较IR组无显著变化。证明甘松挥发油可能通过激活PI3K信号通路，并激活其下游AKT、GSK-3β、eNOS蛋白表达而保护缺血再灌注心脏，并与其剂量大小有关; 激活后的GSK-3β抑制mPTP开放，从而减少心肌损伤，起到保护作用。

本研究表明，心肌缺血再灌注损伤会导致MAP、HR呈下降趋势，甘松挥发油组对大鼠MAP、HR无明显影响; 高剂量甘松挥发油组大鼠心肌梗死面积减少，但心肌缺血面积没有变化，同时心肌损伤标记物CK-MB、cTnT在甘松挥发油组也明显降低，而低剂量甘松挥发油组对大鼠心肌损伤标记物水平、心肌梗死面积则较IR组无变化。DMSO组结果表明，甘松挥发油溶剂DMSO对心肌缺血再灌注损伤作用无影响。根据CKMB、心肌梗死面积提示较高剂量的甘松挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[23]。

综上所述，一定剂量的甘松挥发油可能通过激活PI3K通路，并进一步激活下游GSK-3β等蛋白表达，并进一步抑制mPTP开放从而保护心肌缺血再灌注损伤，但其具体机制还有待进一步研究。