腺苷预处理的局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞线粒体功能观察

裴科阳，谭军，夏艳红，尉娜，王英，赵欣，郭升

(1新乡医学院第三临床学院，河南新乡 453003；2新乡医学院第三附属医院；3新乡医学院第二附属医院；4新郑市人民医院；5新乡医学院第一附属医院)

随着生活水平的提高、膳食结构的不合理、社会人口的老龄化，脑血管疾病发生率较以往有明显的升高，其中缺血性卒中占有较高的比例。以往研究结果表明，缺血再灌注损伤可以明显加重脑卒中的发展；有许多因素涉及这种病理过程，包括兴奋性氨基酸中毒、氧化应激、细胞内钙过载、炎症反应和凋亡。当前治疗的关键环节是抑制脑缺血再灌注损伤，因此应用神经保护剂改善脑缺血再灌注损伤越来越受到关注。腺苷是一种可以在人体内发挥多种生物学效应的内源性核苷，在能量消耗和缺血缺氧的情况下通过激活四种G蛋白偶联受体(A1R、A2aR、A2bR、A3R)使得组织和细胞能够适应其损害。许多实验表明[1～3]，腺苷对脑缺血再灌注损伤有保护作用。脑组织对缺血缺氧十分敏感，而且神经细胞全部进行有氧代谢，需要线粒体提供能量来维持神经元正常生理功能，脑缺血缺氧会造成线粒体功能结构的损伤。线粒体是脑组织缺血后神经细胞死亡的关键亚细胞靶区，神经元能否存活与线粒体的功能完整性有着紧密联系。因此，保护脑缺血后神经细胞的关键是保护线粒体，但既往腺苷对缺血再灌注损伤线粒体功能的影响方面的研究暂时未见文献报道。本研究观察了腺苷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经细胞线粒体功能的影响，旨在为缺血性脑血管病的治疗以及神经细胞线粒体保护作用机制做初步的探索，以期寻找该疾病治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠30只，体质量(250±30)g，饲养于温度湿度通风良好的动物房，室内温度控制在(25±2)℃，不限制饮水及进食。

1.2 腺苷、仪器及试剂 腺苷，钙荧光探针Fura-2AM，MCAO栓线-2626系列，组织线粒体分离试剂盒，BCA蛋白浓度检测试剂盒，PMSF(100 mmol/L)，线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)，超微量Na+-K+-ATP酶测试盒，三磷酸腺苷(ATP)测试盒，多功能酶标仪，荧光分光光度计，紫外可见分光光度计752N。

1.3 实验动物分组、腺苷应用方法及模型制备 30只雄性SD大鼠随机分为3组各10只，腺苷组大鼠制模前3 d腹腔注射腺苷注射液1.5 mg/kg(生理盐水稀释至2 mL)，1次/d，连续3 d；假手术组和模型组给予等量生理盐水。腺苷组和模型组大鼠制备大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，即应用MCAO栓线制备大脑中动脉栓塞模型。给予8%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)于SD大鼠腹腔注射进行术前麻醉，将成功麻醉后的大鼠取仰卧位固定于大鼠解剖专用手术台上，颈部正中皮肤进行备皮并消毒，使用弯镊提起颈部正中皮肤纵向切开皮肤长约2～2.5 cm，使用弯镊沿肌束方向钝性分离肌肉，避免肌肉的损伤或离断，使用玻璃分针对血管、周围神经、筋膜等组织进行分离，分离过程中动作应轻柔，避免造成大鼠神经或血管的离断。充分暴露大鼠的左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，使用无菌缝线将CCA、ECA结扎，动脉夹充分夹闭ICA后，使用眼科剪在CCA离ICA、ECA交叉口上1.0 cm剪出斜形小口，把备好的MCAO栓线小心插入斜形小口后，结扎CCA，栓线头进入到ICA后及时松开ICA上的动脉夹，继续插入尼龙线，使其到达至大脑中动脉(MCA)处，栓线上标记的黑点行至动脉交叉处，插入的深度长约为18～20 mm，将MCA的血流予以阻断。固定结扎尼龙线，然后进行缝皮、消毒，皮肤外的尼龙线使用记号笔涂黑。于栓塞2 h后，固定大鼠将尼龙线轻轻拔出约1 cm，恢复大鼠大脑中动脉及Willis环的血液供应。假手术组仅切开颈部皮肤后，分离暴露ICA、ECA、CCA而不结扎，随后进行逐层缝合并给予消毒，将大鼠放置在电热毯上，保持肛温在37.0 ℃左右，密切观察大鼠生命体征。醒后参照Zeal Longa 5级评分法行神经功能评分，1～3分为有效模型，0分和4分者为无效模型。

1.4 脑组织神经细胞线粒体制备 各组大鼠在脑缺血再灌注22 h后处死，冰上断头取脑，快速取左侧大脑半球并称重，4 ℃生理盐水洗涤组织，眼科剪将脑组织剪成细小碎片，按照组织线粒体提取试剂盒(碧云天)说明书进行两次差速离心法进行操作，分离得到神经细胞线粒体后加入线粒体储存液，制备成神经细胞线粒体悬液，线粒体蛋白含量应用BCA试剂盒检测，新鲜线粒体悬液用于膜电位及钙离子检测，余分装保存于-80 ℃冷冻保存。

1.5 线粒体基质Ca2+检测 取部分新鲜配制的神经细胞线粒体，将50 μL的Fura-2/AM(1 mmol/L)加入神经细胞线粒体悬液中，涡旋混匀，将神经细胞线粒体悬液在37 ℃水浴中孵育30 min进行负载。调整线粒体蛋白含量为1 mg/mL，根据Grynkiewicz的方法[4]，应用荧光分光光度计检测神经细胞线粒体基质Ca2+。

1.6 神经细胞线粒体膜电位检测 采用JC-1试剂盒。取新鲜神经细胞线粒体悬液，按照试剂盒说明操作，用荧光酶标仪检测(激发波长485 nm，发射波长590 nm)，得到相对荧光单位(RFU)，RFU值高表明神经细胞线粒体膜电位正常。

1.7 神经细胞线粒体ATP含量、Na+-K+-ATPase活性检测 -80 ℃分装保存的神经细胞线粒体悬液常温下冻融后，分别取100 μL的神经细胞线粒体混悬液，按试剂盒说明书检测ATP含量以及Na+-K+-ATPase活性。规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为一个ATP酶活性单位。

2 结果

2.1 两组神经细胞线粒体基质Ca2+浓度、膜电位比较 结果见表1。

表1 两组神经细胞线粒体基质Ca2+浓度、膜电位比较

注：与模型组比较，*P<0.05。

2.2 两组神经细胞线粒体Na+-K+-ATPase活性、ATP含量比较 结果见表2。

表2 两组神经细胞线粒体Na+-K+-ATPase活性、ATP含量比较

注：与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

研究[5]表明，脑缺血再灌注损伤的病理生理过程非常复杂，这些过程是相互重叠或相互关联的，最终导致神经坏死或凋亡。还有研究[6]表明，缺血性卒中不仅减少闭塞动脉的血流和组织氧含量，而且减少大脑循环的其他区域供血和供氧，脑缺血缺氧发生时可以导致线粒体结构的破坏，并通过影响线粒体代谢的关键酶，包括氧化磷酸化相关酶(NADH脱氢酶、COX)和三羧酸循环相关酶(丙酮酸脱氢酶β、二氢硫辛酸转乙酰化酶、脂肪酸、氨基酸代谢相关酶)的表达影响线粒体的能量供应，造成ATP合成下降[7,8]，而线粒体损伤则是其中最关键的环节[9]。氧化应激在再灌注过程中引起的线粒体功能障碍是脑缺血再灌注损伤的一个关键致病机制[10]，脑缺血再灌注在极短时间内即可损伤线粒体，随后氧化应激长时间损伤线粒体，最终造成线粒体的永久性破坏[11,12]。脑组织缺血再灌注后ROS大量生成，其会损伤线粒体的蛋白质和mtDNA等，并通过直接和间接的途径调控MPTP开放，导致线粒体膜通透性增加，引起线粒体膜电位下降，释放凋亡相关蛋白，启动线粒体凋亡通路[11]。还有研究发现，脑缺血再灌注后过高的氧化应激水平和钙超载可以引起MPTP持续性开放[13]，致使线粒体膜通透性改变，并最终导致线粒体崩解，进一步触发线粒体凋亡，最终引起细胞死亡[14]。

腺苷是一种重要的核苷信号，在能量消耗和缺血缺氧的情况下通过激活四种G蛋白偶联受体(A1R、A2aR、A2bR、A3R)使得组织和细胞能够适应其损害。细胞外腺苷对应激反应的调节和产生是保护组织的关键。腺苷通过激活其腺苷受体参与许多重要的生理过程，包括调节神经系统、免疫反应、血管功能和代谢[15]。腺苷介导的生物学功能主要依赖于腺苷受体的激活，这些细胞表面受体的反应主要由腺苷浓度决定。由于生理条件下腺苷含量一般低于1 μmol/L，因此腺苷信号的大部分功能是通过激活A1、A2a、A3受体，其EC50值介于0.01～1 μmol。相比之下，A2b受体的激活需要更高腺苷浓度，一般在病理生理条件下存在。随着各种腺苷受体激动剂或拮抗剂和四种腺苷受体敲除小鼠模型的发展和产生，腺苷信号传导已被证明是病理生理条件下通过调节炎症，缺血性组织损伤，纤维化和组织重构[16～18]。研究发现腺苷在缺血性脑血管病、癫痫、疼痛、肺纤维化等多种疾病中具有保护作用。研究[19～21]发现，通过腺苷的预处理，可以明显改善大鼠再灌注损伤引起的神经功能缺失症状，并且减轻了脑组织的损伤程度，同时增加了缺氧诱导因子-1、红细胞生成素、血管内皮生长因子的含量，从而起到对脑组织的保护，证实腺苷有脑保护作用。

线粒体功能的完整性在细胞凋亡中起到关键作用。反映线粒体功能状态的指标也非常多，在细胞的各种生理、病理过程中,ATP是重要的能量分子，一般ATP含量的降低可以说明线粒体的功能下降或者损伤；另外ATP酶存在于细胞或者细胞器的膜上，它在能量转换、物质运送以及信息传递方面具有重要作用，机体存在缺血缺氧时，ATP酶活性会明显下降，影响线粒体功能，造成毒性物质堆积，产生细胞毒性，影响正常细胞生理功能；线粒体膜电位是评估线粒体的敏感指标，其下降是细胞凋亡早期的标志，可以反映早期线粒体功能的损害的敏感指标；线粒体内Ca2+浓度增高在缺血再灌注损伤中起到重要用，可以导致细胞坏死或凋亡。本文结果显示，与假手术组比较，模型组神经细胞线粒体Na+-K+-ATPase活性明显下降，ATP含量降低，膜电位明显降低，提示脑组织神经细胞受损，线粒体处于凋亡状态；神经细胞线粒体基质Ca2+含量增加，表明脑缺血再灌注后，神经细胞内钙离子浓度升高，引起线粒体摄取钙离子增多并导致线粒体内钙离子的过度聚集，抑制ATP的合成，脑缺血后线粒体损伤可能与线粒体内Ca2+超载密切相关。本研究还发现，与模型组比较，腺苷组Na+-K+-ATPase活性和ATP含量升高，线粒体钙离子浓度明显降低，提示腺苷预处理对大鼠缺血再灌注脑组织线粒体功能的损伤具有保护作用。

总之，腺苷预处理能够改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经细胞线粒体的功能。