乳腺浸润性导管癌组织中血管生成拟态和COX-2表达的相关性研究*

黄小环，周铁军，冯晓灵△

(1.重庆三峡医药高等专科学校 404120；2.西南医科大学附属第一医院病理科，四川泸州 646000)

乳腺癌是一种常见的危及女性健康的恶性肿瘤，具有高发病率、高复发率等特点。目前临床上主要采取手术切除、术后放化疗、内分泌治疗等手段，但现有治疗措施仍不能很好控制其发展。恶性肿瘤的快速生长需要血液供应，长久以来一直认为，肿瘤的血管来源于血管发生和血管生成两方面。直到MANIOTIS等[1]提出血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)，一种不依赖于血管内皮细胞的全新肿瘤血供模式，不同于经典血管生成，管壁没有内皮细胞附着，肿瘤细胞排列在管壁外表面，其内可见红细胞、血浆。VM还存在于胃癌、肝细胞癌等多种恶性肿瘤中[2-3]。环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)已经证实为参与VM形成的重要因素之一，本研究拟通过CD34及过碘酸雪夫反应(PAS)双重染色证实乳腺浸润性导管癌中是否存在VM，进一步探讨COX-2与乳腺癌VM的关系，从而探讨VM表达阳性的乳腺癌是否更具有转移和侵袭性，预后是否更差，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 110例患者乳腺癌标本为试验组，来自于西南医科大学附属第一医院病理科2011-2015年手术切除乳腺癌的石蜡块，患者术前未进行放疗或化疗，石蜡切片由两位高年资的病理医师再次阅片确诊为乳腺浸润性导管癌。患者均为女性，年龄28～79岁，肿瘤直径2～8 cm；腋窝淋巴结转移80例，未转移30例；根据WHO乳腺癌分类标准进行病理分级，其中Ⅰ级(高分化)26例，Ⅱ和Ⅲ级(中、低分化)84例。同时选取30例乳腺良性病变患者(乳腺增生15例、乳腺纤维腺瘤15例)作为对照组。

1.2试剂 COX-2单克隆抗体购于cst公司、CD34单克隆抗体购于santa公司、SP法免疫组织化学试剂盒购于bioss公司、PAS染色试剂盒购于solarbio公司。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学 取出蜡块，4 μm厚度连续切片,经二甲苯两次脱蜡；梯度乙醇置换，流水冲洗；将切片架置于柠檬酸液中，放入高压锅中抗原修复；每张切片加入3%过氧化氢，阻断内源性过氧化物酶活性；滴加一抗、Envision试剂和二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素适当复染，脱水透明封片。用已知阳性片做阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

1.3.2CD34和PAS双重染色 先进行CD34免疫组织化学染色，显微镜下观察血管内皮细胞着色后，水流冲洗1 min，终止显色反应；将切片置于0.5%的过碘酸溶液中氧化15 min，蒸馏水冲洗2次，每次3 min，此步骤完成后将切片置于Schiff液中，避光下PAS反应15 min；蒸馏水冲洗3次，每次1 min，流水冲洗3 min；苏木素浅染细胞核1 min，流水冲洗1 min，分化、返蓝，常规脱水、透明，中性树胶封片。

1.3.3VM结果判定 镜下可见由CD34染色阴性的肿瘤细胞围成管道样结构，部分管腔中可见红细胞和血浆；PAS染色阳性物质围成一层基膜样结构，将肿瘤细胞和红细胞分开[4]。对照组乳腺组织中未见上述现象。

1.3.4COX-2免疫组织化学染色结果判定 在细胞膜或细胞质发现有棕黄色物质沉着者为阳性，以细胞染色强度和细胞阳性百分率两者得分相加来进行判定。无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄色为3分；细胞阳性率：≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%为3分。上述两项相加，0～1分为阴性(-)，2～3分为(+)，4分为(++)，5～6分为(+++)，统计时，2～6分均记为阳性。

A、B：VM在试验组组织中表达(箭头示)；C、D：VM在对照组组织中无表达

图1 VM在乳腺组织的表达(CD34、PAS，×400)

2 结 果

2.1VM在乳腺组织的表达 CD34、PAS双重染色后可见PAS染色阳性物质围成一层基膜样结构，将肿瘤细胞和红细胞分开，CD34染色管壁细胞则为阴性，提示管壁细胞不属于内皮细胞。试验组有28例存在VM，阳性率为25.45%，对照组未发现VM，见图1。

2.2VM与乳腺癌临床病理特征的关系 VM阳性表达与患者年龄无关(P>0.05)，与肿瘤大小、病理分级及淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1。

表1 VM和乳腺癌患者临床病理特征的关系

2.3COX-2在乳腺组织的表达 COX-2在试验组有71.2%(79/110)的阳性表达率，对照组组织中有20.0%(6/30)的阳性表达率，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

A：COX-2在试验组组织中表达(箭头示)；B：COX-2在对照组组织中无表达

图2 COX-2在乳腺组织的表达(SP，×200)

2.4COX-2与乳腺癌临床病理特征的关系 COX-2在乳腺癌组织中的阳性表达与患者的年龄和肿瘤大小无关(P>0.05)，与病理分级和淋巴结转移有关(P<0.05)，见表2。

表2 COX-2与乳腺癌临床病理特征的关系

2.5VM与COX-2关系 28例乳腺癌VM阳性患者中，COX-2阳性表达28例，阳性率为100.0%；在82例乳腺癌VM表达阴性的患者中有58例COX-2阳性表达，阳性率为70.7%；COX-2在VM阳性患者中的阳性表达率明显高于VM阴性患者，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

VM局部浸润、转移是恶性肿瘤十分重要的生物学特性，也是决定患者预后的重要因素，决定这些生物学特性的基础之一就是血供，公认的肿瘤血液供应来源于血管生成，直到FOLBERG 等[4]在恶性黑色素瘤中发现了一种全新的血供方式。这种方式的特点为管道内面无血管内皮细胞覆盖，而是被覆模拟血管生成的肿瘤细胞，通过与细胞外的基质相互作用，与存在的血管联系起来，从而为恶性肿瘤细胞的生长提供更多的血液来源。近年研究发现，其他肿瘤组织中也有VM存在，如肺癌[5]、子宫颈癌[6]、卵巢癌[7]等。本研究结果显示，110例乳腺癌组织通过CD34和PAS双重染色，其中28例证实VM存在，与SHIRAKAWA等[8]研究结果一致。近年关于VM与肿瘤临床病理特征相关性的研究中，LIU等[9]对肝癌的研究发现VM与肿瘤大小、病理分期、淋巴结转移有着密切联系，本研究也发现在乳腺癌中也具有这一特点。

COX-2在正常组织细胞中多不表达或低表达，但在多种上皮来源肿瘤中因环境诱导而出现高表达现象。有关研究表明，COX-2在食管癌等多种肿瘤组织中呈现高表达现象，此现象与肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关[10]。在本研究中，COX-2在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于乳腺良性病变组织。COX-2与乳腺癌临床病理特征有关，病理分化越低，COX-2表达反而越高，有淋巴结转移的乳腺癌组织COX-2阳性表达率高于淋巴结未转移组，而与患者年龄、肿瘤大小无关。因此，检测COX-2的表达，可以评估乳腺癌患者的预后，临床上可抑制COX-2的表达，对分化程度低、发生淋巴结转移的患者进行临床干预。

研究表明，COX-2可促进前列腺素E2(PGE2)的表达，PGE2与其受体EP3结合后通过蛋白激酶C(PKC)，激活ERK1/2，调控VM生成[11]。JANA等[12]研究表明，表达COX-2的乳腺癌组织VM表达为阳性，通过抑制COX-2的表达能够使VM的表达被抑制，说明COX-2是促进VM形成的一个重要因素。本研究显示，COX-2在VM阳性患者中的阳性表达率明显高于VM阴性患者，两者在乳腺癌组织中的表达有相关性，说明在乳腺癌VM形成过程中，COX-2起着重要作用。

本课题组下一步拟通过siRNA技术靶向沉默COX-2基因的表达，应用PCR、Western blot等技术检测基因沉默后VM的表达，为后续研究干扰VM的形成，阻断恶性肿瘤生长的血液供应提供新思路，并为恶性肿瘤的基因治疗寻找新的方向。