沙棘胚状体诱导分化技术研究

刘志红，解庆，李周岐

(1.山西农业大学 林学院，山西 太谷 030801；2.西北农林科技大学 林学院，陕西 杨陵 712100)

沙棘(Hippophaerhamnoides)为广泛分布于欧亚大陆的胡颓子科沙棘属树种，植株抗性较强，具有水土保持、防风固沙和改善环境的作用，同时果实具有很高的食用和药用价值，是一种集生态效益、经济效益和社会效益于一身、开发利用价值极高的植物。

目前沙棘植株再生研究多集中在种子和茎尖等器官和组织培养上[1～3]，对离体器官胚状体的诱导研究较少。胚状体开始状态为一个完整植物的雏形，可通过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中取得营养，容易从愈伤组织的表面脱离，在适宜条件下再生成完整植物[4]。徐虹和梁宗锁将中国沙棘(H.rhamnoidessubsp.sinensis)种子培养得到实生苗的胚根、胚轴、子叶、茎尖作材料，接种在诱导分化培养基上，发现通过器官发生途径分化出再生芽，并伴有极少量的胚状体[3]。在前人研究的基础上[5～13]，本文以中国沙棘和蒙古沙棘(H.rhamnoidessubsp.mongolica)为材料，探究不同基因型、基本培养基、激素种类及激素浓度对沙棘胚性愈伤组织诱导和胚状体诱导分化的影响，以期确立高效、稳定的沙棘胚性细胞系，并为体胚发生体系的建立提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为中国沙棘和蒙古沙棘种子，由试验单位提供。

1.2 方法

1.2.1 无菌材料的获得

将中国沙棘种子用流水反复冲洗，在95%乙醇中浸泡20 min后，于超静工作台上置入0.1% HgC12溶液中灭菌10 min，用无菌水冲洗4～5次，消毒滤纸吸干表面水分后接种在培养基上(①1/4 MS(仅调整大量元素，以下同)、②1/2 MS、③1/2MS+IAA 0.1 mg·L-1、④1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1)，经暗培养5 d后转入如1.2.4所示的培养环境，诱导种子萌发生长。10 d后统计萌芽率。

1.2.2 胚性愈伤组织诱导

分别将培养20、25 d种子实生无菌籽苗的子叶(0.5 cm×0.5 cm)、下胚轴切段(长1.0 cm)和胚根(长1.0 cm)接种于1/2MS附加不同浓度配比的6-BA、NAA、IBA的培养基上。MS培养基不利于沙棘培养[1，3]，所以基本培养基选择1/2 MS。25 d后观察诱导情况。

选取在培养基②上培育20 d的中国沙棘和蒙古沙棘无菌材料，以子叶连带子叶以下0.2 cm下胚轴为整体，用无菌的锋利刀片切下后，分别接种到以基本培养基、6-BA、IBA(分别标记为A、B、C)为变化因子构成的L9(34)正交设计培养配方上。基本培养基选择1/2 MS、1/3 MS、1/4 MS培养基，6-BA采用0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-13个水平，IBA采用2.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、1.0 mg·L-13个水平。每组18瓶，每瓶接种1个外植体，3次重复。培养30 d统计胚性愈伤组织的诱导率。参考刘志红等[14]的分析方法，确定试验范围内最适合沙棘胚性愈伤组织诱导的培养基。

1.2.3 胚状体诱导分化

分别将由子叶、下胚轴、子叶连带0.2 cm下胚轴获得的胚性愈伤组织转接到添加不同浓度IBA、KT、6-BA的1/3MS分化培养基上。每组18瓶，每瓶接种1个外植体，3次重复。30 d统计胚状体诱导分化情况。

1.2.4 培养条件及培养基

培养温度(25±2)℃，光照14 h·d-1，光照强度2 000 lx。培养基pH为5.8，均附加蔗糖30 g·L-1，琼脂6 g·L-1及各种激素。

2 结果与分析

2.1 培养基对中国沙棘种子萌芽率的影响

中国沙棘种子接种5 d后，种子露白，均无感染，此时种皮易分泌大量酚类物质使培养基褐化。将种子转接一次，10 d后，不同培养基中种子萌发生长差异显著。据统计结果(表1)，培养基②中种子萌芽率达88.4%，培养基③④中种子萌芽率相对较低，胚根多畸形，可见激素对中国沙棘种子的萌发不利。因此，最适宜于中国沙棘种子萌发生长的是未加任何激素的1/2 MS培养基，和刘丽等[2]沙棘种子萌发的基本培养基筛选结果相似。继续培养5 d，即种子接种20 d(包括转接一次)，可获得诱导胚性愈伤组织的无菌外植体材料。

表1不同培养基及激素浓度对中国沙棘种子萌发生长的影响

Table1 Seedlings growth situation on different culture medium

处理组合No.种子萌芽率/%Seed germina-tion rate籽苗生长状况Seedlings growth situation①75.0幼芽长势良好,根茎健壮②88.4幼芽长势良好,生长快,根茎健壮③66.7根尖呈圆锥状,膨大且多畸形,无根系发育④44.2须根少,主根细长

2.2 胚性愈伤组织诱导

不同外植体对胚性愈伤组织的诱导率差异明显，如表2所示。

表2不同外植体对愈伤组织诱导的影响

Table2 Effect on the induction of embryogenic callus basing different explant

苗龄/天Age处理组合No.因素/mg·L-1Factor诱导率/%Induction ratesNAAIBA6-BA子叶Cotyledon胚根Taproot胚轴HypocotylA0.5 90.9033.320B2.0000C0.030.510028.633.3A0.580.00025B2.0000C0.030.55000

种子培养20 d比培养25 d所得的无菌试验材料诱导率高。其中子叶为外植体，胚性愈伤组织的诱导率较高，子叶是诱导胚性愈伤组织的最佳外植体。胚根、下胚轴的诱导率相对较低，甚至不能诱导得到愈伤组织。试验中还发现，可诱导胚性愈伤组织的下胚轴大多取自近子叶端。激素组合B中均表现外植体明显膨大，淡黄褐色，但无愈伤组织诱导，可能IBA浓度高于2.0 mg·L-1时，对愈伤组织诱导产生抑制。组合C中愈伤组织诱导率很高，但后期极易褐化死亡，可能与外源激素NAA的选择有关。

表3 沙棘胚性愈伤组织诱导的L9(34)正交试验设计与结果Table 3 Induction of embryogenic callus basing L9(34) Orthogonal Design Test

注：W为误差相；R1、R2为极差；K11、K12、K13和 K21、K22、K23分别为中国沙棘和蒙古沙棘胚性愈伤组织诱导各影响因素水平1、水平2、水平3的均值。

Note：W shows error; R1, R2 shows xmax-xmin; K11, K12, K13 shows mean value of level1, level2, level3 forH.rhamnoidessubsp.sinensis; K21, K22, K23 shows mean value of level1, level2, level3 forH.rhamnoidessubsp.Mongolica.

为了进一步研究不同基因型间胚性愈伤组织诱导率是否存在差异和优化胚性愈伤组织诱导培养基，选择基本培养基、6-BA、IBA为变化因子构成的L9(34)正交设计培养配方(表3)。子叶和近子叶端的下胚轴均可见胚性愈伤组织的诱导(表2)，因此在优化试验中选择了子叶连带0.2 cm下胚轴为外植体。

不同基因型间，胚性愈伤组织诱导率存在差异，其中中国沙棘诱导率相对较高。由极差计算表明，各因素对胚性愈伤组织诱导起作用的顺序为C(IBA)>B(6-BA)>A(基本培养基)，细胞分裂素6-BA和生长素IBA浓度对胚性愈伤组织诱导具有显著作用。基本培养基对胚性愈伤组织诱导作用不明显。各因素的最优水平分别为A1、B1、C3，因此，筛选的胚性愈伤组织诱导最适培养基为1/3 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1。

2.3 胚状体诱导分化

胚状体发育过程与合子胚相似，发生的最早阶段具有两极性，即茎端(胚芽)和根端(胚根)。在适宜的培养基上，可诱导胚状体分化发育，经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶胚等几个阶段。子叶胚阶段体积较大，较直观。

由子叶、胚轴获得的胚性愈伤组织难以继续分化。由子叶连带0.2 cm胚轴诱导的胚性愈伤组织则可见胚状体的分化(表4)。IBA浓度为0.3 mg·L-1，可见子叶胚，但部分子叶胚出现脱分化现象；降低IBA浓度至0.05 mg·L-1，胚状体分化且子叶胚生长正常。低浓度的6-BA对胚状体分化有一定的影响，每个外植体平均诱导分化个数随其浓度的升高而增多，但分化率不随其浓度变化而变化。培养基中添加KT，可增加每个外植体胚状体诱导分化个数，也可以提高分化率。本试验筛选的胚状体诱导分化最适培养基为1/3 MS+IBA 0.05 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1。

将获得的子叶胚转接至1/3 MS+IBA 0.05 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1培养基，继续生长发育。相对于直接由种子萌发所得实生籽苗，由胚状体发育而成的幼苗子叶肥厚，胚轴粗短，胚根略粗。

表4 不同种类和浓度的植物生长调节剂对沙棘胚状体诱导分化的影响Table 4 Effects of different hormones on the somatic embryogenesis induction

3 结论与讨论

室内非无菌环境诱导沙棘种子萌发所得外植体消毒极为困难，污染率高，且材料幼嫩，在消毒过程中易失去活性，这是获得沙棘胚性愈伤组织试验材料的一大障碍。为了消除这一障碍，本试验直接在无菌条件下培养种子，采用无菌种子萌发所得的胚轴、胚根、子叶等为材料进行组织培养，极大的减少了污染。

在不添加激素的1/2 MS培养基上，诱导中国沙棘种子萌发的萌芽率最高，且长势良好，种子培育20 d可获得大量无菌试验材料。在添加激素的培养基上，中国沙棘种子虽然也能萌发，但多表现为生长缓慢或根系畸形。

试验范围内，1/3 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1适合胚性愈伤组织的诱导，诱导率可达75.9 %；胚状体诱导分化的最佳培养基为1/3 MS+IBA 0.05 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1。在细胞的胚性化过程中，激素调控了植物细胞分化、生长方向和进程，但组织在离体培养条件下合成生长素和细胞分裂素的能力较低，在培养基中添加适当种类和浓度的植物激素是成功诱导胚性愈伤组织和胚状体分化的重要因素[15～22]。

胚性愈伤组织诱导率存在基因型间的差异，其中中国沙棘诱导率相对较高。IBA对沙棘胚性愈伤组织诱导具有显著作用，表明IBA是促进外植体细胞分化形成胚性愈伤组织所必需的植物激素，6-BA只对中国沙棘胚性愈伤组织诱导具有显著作用，可能与不同基因型间内源激素的组成和水平有关。低浓度的IBA和6-BA对胚状体分化有一定的影响。培养基中添加KT，可增加每个外植体胚状体诱导分化个数，提高分化率，这可能与三者的合理配比所起协同作用有关，协同作用大小及机理有待于进一步深入研究。通过胚胎发生途径得到胚状体的同时，仍可见通过器官发生途径分化出的再生芽，仅诱导出现胚状体的培养基(含激素配比)还需继续试验分析。

以子叶连带0.2 cm胚轴为材料可诱导胚状体分化，而单独的子叶或胚轴难以诱导胚状体分化，我们推测近子叶端的下胚轴较易形成胚状体，连带的子叶为胚状体生长发育提供营养和内源激素的调控。